4.2.1. Hiệu quả ức chế đƣờng kính khuẩn lạc của các loại thuốc
Một trong những tác động của thuốc trừ nấm lên một loại nấm ký sinh là khả năng ức chế sự phát triển của khuẩn lạc. Việc thực hiện thử nghiệm in vitro bằng phƣơng pháp đầu độc môi trƣờng (poisioned food technique) đã chuẩn hoá và đƣợc các nhà nghiên cứu BVTV áp dụng rộng rãi. Phƣơng pháp này không những cho phép đánh giá nhanh hiệu quả của thuốc trừ nấm trên một loại nấm ký sinh, mà còn
có chi phí thấp. Qua thử thuốc bằng phƣơng pháp in vitro xác định đƣợc chỉ số LD50 (liều làm chết 50% cá thể), từ đó xác định đƣợc nồng độ của thuốc khi áp dụng ngoài đồng. Chẳng hạn, nhƣ đối với Validacin 5L nồng độ thuốc có hiệu lực ngoài đồng bằng LD50*100. Phƣơng pháp đầu độc môi trƣờng đã đƣợc áp dụng trên
C. samonicolor, Phytophthora spp gây bệnh nấm hồng và loét sọc mặt cạo (Huỳnh Hữu Tấn, 1996), trên C. gloeosporioides gây bệnh héo đen đầu lá (Radziah & Omar, 1985 - trích dẫn bởi Nguyễn Đôn Hiệu, 2004).
Đề tài bƣớc đầu sử dụng phƣơng pháp này để đánh giá hiệu lực của một số thuốc trừ nấm gốc Triazole trên C. cassiicola. Tiếp theo, những loại thuốc và nồng độ thích hợp sẽ đƣợc khảo sát trên lá cao su cắt rời trong phòng thí nghiệm (phƣơng pháp in vivo) và từ kết quả này làm cơ sở để chọn đƣợc loại thuốc và nồng độ thích hợp nhất áp dụng ra ngoài đồng ruộng.
Thí nghiệm in vitro đƣợc tiến hành đánh giá tốc độ phát triển của nấm
C. cassiicola bằng phƣơng pháp đầu độc môi trƣờng với các loại thuốc trừ nấm. Những loại thuốc nào có hiệu quả trị nấm tốt thì khuẩn ty sẽ kém phát triển hoặc bị ức chế hoàn toàn so với nghiệm thức đối chứng không xử lý thuốc. Đƣờng kính khuẩn lạc đƣợc theo dõi hàng ngày trong suốt thời gian thí nghiệm, kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.1.
Theo dõi trên bảng 4.1, ở ngày đầu tiên, thuốc Hexaconazole ức chế hoàn toàn sự phát triển của nấm ở ngay nồng độ thấp là 2,5 ppm. Điều này chứng tỏ
Hexaconazole cho hiệu quả ức chế cao nhất ngay từ những ngày đầu tiên. Các ngày tiếp theo, thuốc Hexaconazole cũng ức chế hoàn toàn sự phát triển khuẩn ty ở các nồng độ 12,5 và 25 ppm.
Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của thuốc trừ nấm đến đƣờng kính khuẩn lạc C. cassiicola Thuốc Nồng độ
(ppm-ai)
Đƣờng kính khuẩn lạc trung bình (cm) % Ức chế đƣờng kính khuẩn lạc 1 ngày 3 ngày 5 ngày 7 ngày 1 ngày 3 ngày 5 ngày 7 ngày
Cyproco- nazole 0,1 1,2 2,5 4,1 5,5 27,1 36,6 38,4 36,9 0,5 0,9 1,8 3,0 3,8 44,7 55,6 55,5 55,6 2,5 0,5 1,0 1,6 2,2 65,6 74,8 76,7 74,8 12,5 0,0 0,0 0,3 0,3 100,0 100,0 96,3 96,5 25 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0 100,0 100,0 100,0 Difenoco- nazole 0,1 1,0 2,1 3,2 4,3 34,9 49,0 52,1 50,5 0,5 0,9 1,5 2,3 3,1 42,8 64,0 66,4 64,4 2,5 1,0 1,7 2,3 3,0 34,8 58,4 65,1 65,8 12,5 0,9 1,6 2,2 2,6 43,4 60,9 67,4 69,9 25 0,3 1,4 2,0 2,4 83,7 64,7 69,4 72,0 Flusila- zole 0,1 0,9 1,9 3,1 4,2 42,3 52,8 52,3 51,3 0,5 0,8 1,4 2,3 3,1 48,8 65,7 64,3 64,0 2,5 0,5 1,0 1,6 2,1 65,6 75,8 76,1 75,1 12,5 0,0 0,0 0,8 1,1 100,0 100,0 87,3 87,9 25 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0 100,0 100,0 100,0 Hexaco- nazole 0,1 0,9 1,9 3,0 4,1 43,2 54,1 54,8 53,0 0,5 0,8 1,3 2,1 2,9 48,8 68,5 68,0 66,3 2,5 0,0 0,9 1,3 1,7 100,0 78,4 80,7 79,9 12,5 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0 100,0 100,0 100,0 25 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0 100,0 100,0 100,0 Triadime- nol 0,1 1,2 3,0 4,8 6,5 21,4 25,0 27,0 24,9 0,5 1,0 2,2 3,6 4,8 36,7 44,4 45,5 44,1 2,5 0,8 1,7 2,8 3,7 48,5 58,2 57,5 57,0 12,5 0,0 1,0 1,9 2,6 100,0 75,0 71,5 69,5 25 0,0 0,8 1,2 1,8 100,0 79,2 81,5 79,8 Tebuco- nazole 0,1 1,2 2,9 4,8 6,6 22,0 28,9 27,9 23,8 0,5 0,9 2,2 3,8 5,1 41,2 44,5 42,7 41,2 2,5 0,8 1,4 2,5 3,4 48,8 64,0 62,5 60,7 12,5 0,3 1,1 1,7 2,1 83,1 73,7 74,6 75,8 25 0,0 0,9 1,4 1,6 100,0 78,3 79,5 81,0 Triacy- clazol 0,1 1,5 3,4 5,7 7,4 6,8 14,6 15,8 14,5 0,5 1,3 2,9 4,8 6,5 19,8 27,3 27,9 25,2 2,5 1,3 3,0 5,0 6,9 15,1 25,2 25,4 21,1 12,5 1,5 3,5 5,9 8,0 3,2 12,2 11,8 8,1 25 1,4 3,1 5,0 6,9 13,6 23,5 25,3 20,2 Propico- nazole 0,1 1,1 2,6 4,3 5,9 32,6 36,3 35,6 32,1 0,5 0,9 2,0 3,4 4,5 42,6 49,9 49,6 47,5 2,5 0,8 1,2 2,2 3,0 49,3 69,1 67,3 65,0 12,5 0,0 0,9 1,4 1,8 100,0 78,3 79,0 79,2 25 0,0 0,9 1,2 1,5 100,0 78,3 82,0 82,6 Triadime- fon 0,1 1,3 3,3 5,4 7,4 18,0 17,2 18,6 14,4 0,5 1,2 2,9 4,8 6,7 26,7 28,3 26,9 22,9 2,5 1,1 2,5 4,1 5,6 30,6 38,3 37,9 35,1 12,5 1,0 2,1 3,5 4,7 37,8 49,0 47,8 45,2 25 0,6 1,8 2,7 3,7 63,4 56,4 59,3 57,8 Đối chứng 0 1,6 4,0 6,7 8,7 0,0 0,0 0,0 0,0
Thuốc Cyproconazole và Flusilazole nồng độ 25 ppm cũng có hiệu quả ức chế 100% ở tất cả các ngày theo dõi, nhƣng ở nồng độ 12,5 ppm thì các thuốc này chỉ cho hiệu quả ức chế 100% ở những ngày đầu, đến ngày thứ 5 thì khuẩn ty đã mọc lan xuống môi trƣờng mới. Có lẽ ở nồng độ đó chƣa đủ sức diệt hoàn toàn khuẩn tynên chúng đã bắt đầu thích nghi đƣợc với môi trƣờng bị đầu độc.
Các thuốc Propiconazole và Triadimenol nồng độ 12,5 và 25 ppm; thuốc
Tebuconazole nồng độ 25 ppm thì chỉ cho hiệu quả ức chế 100% ở ngày đầu tiên, ở các ngày tiếp theo khuẩn ty đã có thể phát triển xuống môi trƣờng.
Thuốc Difenoconazole, Triadimefon và Triacyclazole đều không cho thấy hiệu quả ức chế 100% kể cả ở nồng độ cao nhất là 25 ppm.
Hiệu quả ức chế đƣờng kính khuẩn lạc so với đối chứng (không xử lý thuốc) của các loại thuốc đƣợc xử lý thống kê theo kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên 2 yếu tố là thuốc và nồng độ, kết quả đƣợc nêu trong phụ lục 1.1. Bảng Anova ở các phụ bảng 1.1.1, phụ bảng 1.1.2, phụ bảng 1.1.3 và phụ bảng 1.1.4 đều cho thấy có sự khác biệt rất nhiều giữa các loại thuốc cũng nhƣ giữa các nồng độ với nhau, đồng thời sự tƣơng tác giữa thuốc và nồng độ là rất có ý nghĩa (P = 0,0000 < 0.001).
Khi so sánh phân hạng các loại thuốc, cho thấy thuốc Hexaconazole và Flusilazole
luôn có hiệu quả ức chế cao nhất ở tất cả các ngày theo dõi. Thuốc Cyproconazole
có hiệu quả tƣơng đƣơng Flusilazole, nhƣng kém hơn Hexaconazole và cao hơn các thuốc khác.
Thuốc Difenoconazole có hiệu quả ức chế kém ở những ngày đầu (kém hơn thuốc
Propiconazole, Triadimenol, Tebuconazole; phụ bảng 1.1.1), nhƣng hiệu quả tăng dần cho đến ngày thứ 5 và thứ 7 thì hiệu quả ức chế cao hơn thuốc Triadimenol và
Tebuconazole.
Thuốc Propiconazole hầu nhƣ không thể hiện sự khác biệt so với các thuốc
Difenoconazole, Tebuconazole, Triadimenol. Chỉ đến ngày thứ 7 thuốc
Propiconazole mới cho thấy hiệu quả cao hơn Triadimenol. Còn thuốc Triadimenol
Thuốc Triacyclazole luôn cho hiệu quả ức chế kém nhất, thuốc Triadimefon cũng cho hiệu quả kém hơn các thuốc khác ở tất cả các ngày theo dõi (phụ lục 1.1).
Bảng 4.1 còn cho thấy hầu hết các loại thuốc khi nồng độ tăng dần thì hiệu quả ức chế cũng tăng dần, chỉ trừ thuốc Difenoconazole và Triacyclazole. Trong thuốc
Difenoconazole, khi nồng độ tăng từ 0,5 đến 25 ppm thì hiệu quả ức chế hầu nhƣ không có sự khác biệt (phụ bảng 1.1.5). Trong thuốc Triacyclazole khi nồng độ tăng từ 0,1 đến 0,5 thì hiệu quả ức chế tăng lên cao nhất, rồi lại giảm dần đến thấp nhất ở nồng độ 12,5; sau đó mới tăng lên khi nồng độ tăng lên 25 ppm. Khi xử lý thống kê thì cho thấy các nồng độ của thuốc Triacyclazole không có sự khác biệt về hiệu quả ức chế (phụ bảng 1.1.6).
Điều này cũng đƣợc thể hiện rõ trong bảng 4.2, thuốc Difenoconazole từ nồng độ 0,5 đến 25 thì tốc độ phát triển đƣờng kính khuẩn lạc hầu nhƣ không thay đổi, còn Triacyclazole thì tốc độ cao nhất ở nồng độ 12,5. Điều này có lẽ do hiệu quả ức chế ngƣợc của thuốc Triacyclazole khi nồng độ tăng ở mức nhất định thì kích thích sự phát triển của nấm, còn nồng độ thấp hơn hoặc cao hơn thì lại ức chế mạnh hơn. Các loại thuốc khác là Cyproconazole, Flusilazole, Hexaconazole, Triadimenol, Tebuconazole, Propiconazole và Triadimefon đều có tốc độ phát triển đƣờng kính khuẩn lạc giảm khi nồng độ thuốc tăng (bảng 4.2). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhìn chung, tất cả các nghiệm thức đều có tốc độ phát triển đƣờng kính tăng dần từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 5, sau đó lại giảm dần đến ngày thứ 7 (bảng 4.2). Điều này hợp với quy luật phát triển của vi sinh vật nói chung và vi nấm nói riêng, vì trong thời gian 1 – 2 ngày đầu nấm mới cấy vào cần thời gian thích nghi với môi trƣờng mới, sau đó chúng mới phát triển nhanh và khi có mật độ lớn thì tốc độ phát triển giảm dần vì lý do dinh dƣỡng và diện tích giới hạn.
Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của thuốc trừ nấm đến tốc độ phát triển đƣờng kính khuẩn lạc
Thuốc Nồng độ (ppm-ai) Tốc độ phát triển đƣờng kính khuẩn lạc (cm/ngày) 1 - 3 ngày 3 - 5 ngày 5 - 7 ngày Trung bình
Cyproconazole 0,1 0,70 0,77 0,68 0,72 0,5 0,45 0,59 0,45 0,50 2,5 0,24 0,27 0,31 0,28 12,5 0,00 0,14 0,02 0,05 25 0,00 0,00 0,00 0,00 Difenoconazole 0,1 0,52 0,58 0,54 0,55 0,5 0,27 0,40 0,42 0,37 2,5 0,32 0,32 0,33 0,32 12,5 0,34 0,30 0,22 0,28 25 0,58 0,31 0,19 0,36 Flusilazole 0,1 0,48 0,63 0,53 0,55 0,5 0,28 0,49 0,38 0,38 2,5 0,21 0,30 0,29 0,27 12,5 0,00 0,42 0,10 0,18 25 0,00 0,00 0,00 0,00 Hexaconazole 0,1 0,48 0,59 0,52 0,53 0,5 0,23 0,44 0,39 0,35 2,5 0,43 0,21 0,23 0,29 12,5 0,00 0,00 0,00 0,00 25 0,00 0,00 0,00 0,00 Triadimenol 0,1 0,88 0,91 0,83 0,87 0,5 0,61 0,68 0,61 0,64 2,5 0,43 0,57 0,45 0,48 12,5 0,50 0,45 0,37 0,44 25 0,42 0,20 0,26 0,29 Tebuconazole 0,1 0,81 0,97 0,90 0,89 0,5 0,65 0,79 0,64 0,69 2,5 0,32 0,52 0,46 0,43 12,5 0,39 0,31 0,21 0,30 25 0,43 0,24 0,14 0,27 Triacyclazol 0,1 0,99 1,11 0,88 0,99 0,5 0,83 0,95 0,82 0,87 2,5 0,84 0,99 0,92 0,92 12,5 1,01 1,19 1,03 1,08 25 0,86 0,97 0,95 0,93 Propiconazole 0,1 0,74 0,86 0,80 0,80 0,5 0,55 0,67 0,59 0,60 2,5 0,22 0,46 0,43 0,37 12,5 0,44 0,26 0,20 0,30 25 0,44 0,17 0,15 0,25 Triadimefon 0,1 1,01 1,05 0,99 1,02 0,5 0,85 0,99 0,90 0,92 2,5 0,68 0,81 0,75 0,75 12,5 0,53 0,71 0,63 0,62 25 0,59 0,48 0,47 0,51 Đối chứng 0 1,22 1,33 0,99 1,18
Tóm lại, qua sự phát triển của nấm trong từng giai đoạn có thể rút ra kết luận rằng thuốc Hexaconazole và Flusilazole có hiệu quả ức chế cao nhất, thuốc
Cyproconazole có hiệu quả ức chế cao thứ 3. Thuốc Difenoconazole cũng có hiệu quả ức chế cao ngay từ nồng độ thấp nhƣng khi tăng nồng độ lên cao 25 ppm thì hiệu quả ức chế tăng rất ít chỉ đạt 72%. Điều này chứng tỏ để đạt hiệu quả ức chế 100% thì thuốc Difenoconazole cần nồng độ rất cao (điều này sẽ đƣợc thấy rõ hơn trong khi xử lý tƣơng quan hồi quy - bảng 4.3).
Bảng 4.3: Phƣơng trình tƣơng quan tuyến tính và chỉ số LD50 của các loại thuốc sau 7 ngày nuôi cấy.
Thuốc Phƣơng trình tƣơng quan tuyến tính (Y = bX + a) Hệ số tƣơng quan (R) Giá trị xác xuất (P) LD50 LD99 Cyproconazole Y = 27,0053X + 10,3137 0,998052 0,0001 0,2948 19,232 Difenoconazole Y = 7,91923X + 46,3682 0,931434 0,02133 0,0287 44267 Flusilazole Y = 19,112X + 31,5271 0,991204 0,00099 0,0926 33,915 Hexaconazole Y = 20,9658X + 31,1211 0,992965 0,00071 0,0795 17,282 Triadimenol Y = 21,5622X + 5,37855 0,995469 0,00037 1,1734 219,75 Tebuconazole Y = 24,3444X - 0,219241 0,998072 0,0001 1,1558 119,03 Triacyclazol Y = -1,33733X + 20,4185 -0,195895 0,75218* Propiconazole Y = 21,7469X + 10,6099 0,997317 0,00017 0,6476 116,01 Triadimefon Y = 17,374X - 5,53363 0,985076 0,00218 15,717 10391
(Ghi chú: * giá trị xác xuất (P) > 0,05 suy ra bác bỏ phƣơng trình tƣơng quan tuyến tính) Trong đó: X = Lg(C*100)
C: nồng độ thuốc (ppm a.i.)
Y: % ức chế đƣờng kính khuẩn lạc
Bảng 4.3 cho thấy mối tƣơng quan giữa sự ức chế đƣờng kính khuẩn lạc và nồng độ của các thuốc Cyproconazole, Flusilazole, Hexaconazole, Triadimenol, Tebuconazole, Propiconazole, Triadimefon là rất chặt chẽ và đáng tin cậy (hệ số tƣơng quan biến động từ 0,9851 đến 0,9981; giá trị P < 0,01). Còn đối với thuốc
Difenoconazole thì mối tƣơng quan cũng khá cao (R = 0,9314) nhƣng có độ tin cậy trung bình (0,01 < P < 0,05). Hơn nữa phƣơng trình tuyến tính của thuốc
Difenoconazole lại có hệ số góc (Slope, b = 7,91923) nhỏ hơn các loại thuốc khác. Điều này có nghĩa là yếu tố nồng độ của thuốc Difenoconazole ít ảnh hƣởng đối với hiệu quả ức chế nấm. Chính vì vậy mà khi tính chỉ số LD99 (liều lƣợng làm chết 99% cá thể) của thuốc Difenoconazole thì cho giá trị rất cao (44267 ppm), tuy nhiên chỉ số LD50 của Difenoconazole lại thấp nhất (0,0287 ppm).
Theo phƣơng pháp đánh giá của Finney (1968) thì các loại thuốc Cyproconazole, Difenoconazole, Flusilazole, Hexaconazole, Triadimenol, Tebuconazole, Propiconazole
đều có hiệu lực trị nấm rất cao (LD50 < 10 ppm a.i.), thuốc Triadimefon có hiệu quả trung bình, còn thuốc Triacyclazole là không có hiệu lực (thuốc Triacyclazole có P > 0,05 nên không có mối tƣơng quan rõ ràng giữa nồng độ thuốc và hiệu quả ức chế nấm).
Hình 4.3. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc
Hình 4.4. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc
Difenoconazole sau 7 ngày cấy nấm
Hình 4.5. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc
Hình 4.6. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc
Hexaconazole sau 7 ngày cấy nấm
Hình 4.7. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc
Hình 4.8. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc
Tebuconazole sau 7 ngày cấy nấm
Hình 4.9. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc
Hình 4.10. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc
Propiconazole sau 7 ngày cấy nấm
Hình 4.11. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc
Trong quá trình thí nghiệm, theo dõi mật độ khuẩn ty thì thấy ở các đĩa đối chứng và các đĩa bổ sung thuốc Triacyclazole đều có khuẩn tymọc thƣa hơn tất cả các thuốc khác. Điều này chứng tỏ rằng, khi không có sự ức chế trên môi trƣờng thì khuẩn ty dễ mọc lan rộng ra và do đó chúng mọc thƣa hơn. Còn ở những nghiệm thức có sự ức chế cao thì khuẩn ty không mọc lan rộng ra đƣợc và chúng phải mọc dày lại. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhƣ vậy, có thể đi đến kết luận rằng thuốc Triacyclazole là cho hiệu quả ức chế nấm trên môi trƣờng in vitro không cao, thuốc Triadimefon cho hiệu quả ức chế trung bình, Difenoconazole cho hiệu quả ức chế cao ngay từ nồng độ thấp nhƣng khi tăng nồng độ lên cao thì hiệu quả lại tăng rất ít. Còn các thuốc Cyproconazole, Flusilazole, Hexaconazole, Triadimenol, Tebuconazole, Propiconazole đều cho hiệu quả ức chế cao, trong đó cao nhất là Hexaconazole, Flusilazole kế đến là
Cyproconazole, Propiconazole, Tebuconazole và Triadimenol.
4.2.2. Ảnh hƣởng của thuốc đến mật độ, kích thƣớc và tỉ lệ nảy mầm của bào tử
Ngoài việc ức chế về sự phát triển và hình thái của khuẩn lạc, thuốc trừ nấm còn có tác động đến bào tử do nấm tạo ra về số lƣợng và kích thƣớc. Những bào tử này cũng bị ảnh hƣởng đến sức sống qua sự nảy mầm và phát triển của ống mầm (germtube). Điều này là rất có ý nghĩa, bởi vì mật độ bào tử và sự nảy mầm của bào tử nấm thƣờng liên quan tới khả năng gây bệnh của chúng, nếu mật độ và tỉ lệ nảy mầm cao thì cũng đồng nghĩa là khả năng lây lan và xâm nhiễm cao hơn. Nhƣ vậy, không những hạn chế sự bùng phát trở lại của mầm bệnh mà còn giảm thiểu nguy cơ xuất hiện những chủng nấm kháng thuốc, gây khó khăn cho việc quản lý bệnh sau này.
Các thuốc đƣợc sử dụng trong thí nghiệm này đều thuộc nhóm Triazole, thế hệ thuốc trừ nấm lƣu dẫn mới. Ngoài khả năng lƣu dẫn trong cây, chúng cũng có tính năng hấp thu và dịch chuyển trong tế bào của nấm. Chúng có tác dụng kìm hãm quá trình sinh tổng hợp và chuyển hoá lanosterol thành ergosterol (một tiền chất vitamin D của tế bào nấm), dẫn tới sự ảnh hƣởng đến quá trình hình thành vách tế bào, làm