3.2.2.1. Các loại môi trƣờng dùng trong nuôi cấy và phân lập
Saline Peptone Water (SPW)
Đây là môi trƣờng dùng để pha loãng VSV trong quá trình định lƣợng. Tiến hành pha chế trong cốc thuỷ tinh, khuấy cho tan và phân phối vào mỗi ống nghiệm 9ml, hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Thành phần gồm:
Peptone 1g
NaCl 8,5g
Nƣớc cất 1000ml
Plate Count Agar (PCA)
Đây là môi trƣờng thạch dùng để định lƣợng tổng sinh vật hiếu khí, tiến hành pha trong chai, hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, sau đó lắc đều. Thành phần gồm: Peptone 5,0g Cao nấm men 2,5g Glucose 1g Agar 14g Nƣớc cất 1000ml
Trypton Soya Agar (TSA)
Đây là môi trƣờng thạch không chọn lọc đƣợc hấp khử trùng ở 121o C trong 15 phút, trƣớc khi hấp khử trùng phải đun để tan hết agar. Thành phần gồm: Trypticase peptone 15g Phytone peptone 5g NaCl 5g Agar 15g Nƣớc cất 1000ml
Môi trƣờng này đƣợc dùng trong qui trình định lƣợng Coliforms tổng số. Đây là môi trƣờng thạch đĩa nhƣng không đƣợc hấp khử trùng. Vì vậy, phải đong trƣớc một thể tích xác định nƣớc cất vào chai, hấp ở 121oC trong 15phút. Sau đó, tiếp tục cân môi trƣờng khô vào và đun tan. Tất cả các thao tác này phải đƣợc tiến hành trong điều kiện vô trùng. Thành phần gồm:
Cao nấm men 3g Peptone 7g NaCl 5g Muối mật 1,5g Lactose 10g Neutral red 0,03g Crystal violet 0,002g Agar 18g Nƣớc cất 1000ml
Brilliant Green Bile Lactose (BGBL)
Đây là môi trƣờng lỏng nên đƣợc pha trong cốc thuỷ tinh, khuấy cho tan, sau đó bơm phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm rồi cho ống Durham ngƣợc vào, đậy nút bông, hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Sau khi hấp xong quan sát xem các ống có sinh hơi không, nếu thấy sinh hơi thì không sử dụng. Thành phần gồm: Peptone 10g Lactose 10g Mật bò 20g Brilliant green 0,0133g Nƣớc cất 1000ml
Eosin Methyl Blue (EMB)
Đây là môi trƣờng thạch dùng để phân lập E. coli và môi trƣờng đƣợc hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, để nguội ở 45oC rồi đỗ đĩa. EMB là môi trƣờng rất dễ bị nhiễm mốc, do đó phải đƣợc pha trƣớc một ngày. Thành phần gồm:
Peptone 10g Lactose 5g Sucrose 5g K2PO4 (dikali phosphat) 2g Eosin 0,4g Methyl blue 0,065g Agar 13,5g Nƣớc cất 1000ml
Baird Parker Agar (BPA)
Đây là môi trƣờng dùng để phân lập Staphylococcus aureus. Môi trƣờng đƣợc hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Sau khi hấp xong thì giữ ấm ở 45oC rồi bổ sung thêm EY (Egg yorlk tellurite), trộn đều tránh tạo bọt khí, đổ đĩa, phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Thành phần gồm:
Tryptone 10g Cao thịt 5g Cao nấm men 1g Sodium pyruvate 10g Glycine 10g Lithium chloride.6H2O 5g Agar 15g
Egg yorlk tellurite 50ml
Nƣớc cất 1000ml
Buffered Peptone Water (BPW)
Đây là môi trƣờng tiền tăng sinh Salmonella, đƣợc hấp khử trùng ở 121o C trong 15 phút. Thành phần gồm: Peptone 10g NaCl 5g Na2HPO4.12H2O 9g KH2PO4 1,5g
Nƣớc cất 1000ml
Rappaport Vassiliadis Soy Peptone (RV)
Đây là môi trƣờng dùng để tăng sinh chọn lọc Salmonella, đƣợc hấp khử trùng ở 115oC trong 15 phút. Thành phần gồm: Peptone 4,5g MgCl2.6H2O 28,6g NaCl 7,2g K2HPO4 0,18g KH2PO4 1,26g
Malachite green oxalate 0,036g
Nƣớc cất 1000ml
Xylose Lysine Desoxycholate (XLD)
Đây là môi trƣờng thạch dùng để phân lập Salmonella, môi trƣờng này
không đƣợc hấp khử trùng, do đó phải đong trƣớc một thể tích xác định nƣớc cất
vào chai, hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Sau đó, cân môi trƣờng khô vào,
đun tan đổ đĩa, tất cả các thao tác thực hiện trong điều kiện vô trùng. Thành phần
gồm:
Cao nấm men 3g
NaCl 5g
D(+)xylose 3,5g
Lactose 7,5g
Sucrose 7,5g
L(+)lysine 5,0g
Sodium desoxycholate 2,5g
Sodium thiosulphate 6,8g
Ammonium iron citrate 0,8g
Phenol red 0,08g
Agar 13,5g
3.2.2.2. Môi trƣờng dùng để thử sinh hoá
Simmons Citrate
Đây là môi trƣờng thạch nghiêng nên phải đƣợc pha trong cốc, đun cho tan hết agar, phân phối vào mỗi ống nghiệm khoảng 7ml, đậy nắp, hấp ở 121o
C trong 15 phút. Thành phần gồm: Sodium citrate 2g NaCl 5g K2HPO4 41g NH4H2PO4 41g MgSO4 0,2g Bromothymol blue 0,08g Agar 15g Nƣớc cất 1000ml
Huyết tƣơng tƣơi đông lạnh
Urea Broth
Đây là môi trƣờng không đƣợc hấp khử trùng, nƣớc cất phải đong một thể tích chính xác vào chai, hấp ở 121oC trong 15 phút. Sau đó, cân môi trƣờng vào lắc cho tan hết, lọc qua màng lọc rồi phân phối vào mỗi ống nghiệm 5ml, thực hiện trong điều kiện vô trùng. Thành phần gồm:
Urea 20g Cao nấm men 0,1g Na2HPO4 49,5g K2HPO4 49,1g Phenol red 0,01g Nƣớc cất 1000ml
Canh Manitol Phenol Red
Đây là môi trƣờng thạch nghiêng nên đƣợc pha trong cốc, sau đó đun tan rồi phân phối vào mỗi ống nghiệm 5ml, đem hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Thành phần gồm:
Mannitol 10g
Phenol red broth base 15g
Nƣớc cất 1000ml
Lysine Decarboxylase
Đây là môi trƣờng lỏng, pha trong cốc thủy tinh, phân phối vào mỗi ống nghiệm 5ml, hấp ở 121oC trong 15 phút. Thành phần gồm:
L-lysine HCl 0,5g
Dextrose 0,5g
KH2PO4 40,5g
Nƣớc cất 100ml
Kligler Iron Agar (KIA)
Đây là môi trƣờng thạch nghiêng sâu, đƣợc pha vào trong cốc thủy tinh, đun cho tan hết agar, phân phối vào mỗi ống nghiệm 5ml, hấp ở 121oC trong 15 phút. Sau đó, lắc đều và làm nghiêng ống sao cho sau khi môi trƣờng đông đặc phải có phần sâu khoảng 2cm. Thành phần gồm:
Peptone 20g Lactose 10g Dextrose 10g NaCl 5g Feric ammonium 0,5g Sodium thiosulphate 0,5g Agar 15g Phenol red 0,025g Nƣớc cất 1000ml Canh Tryptone
Môi trƣờng này đƣợc sử dụng để thử nghiệm phản ứng indol. Đây cũng là môi trƣờng lỏng, pha trong cốc, phân phối vào mỗi ống nghiệm 5ml, hấp 121oC trong 15 phút. Thành phần:
Tryptone 20g
NaCl 5g
Nƣớc cất 1000ml
Methyl Red Vosger – Proskauer (MR – VP)
Môi trƣờng này đƣợc sử dụng để thử phản ứng Methyl red và Voges Proskauer. Đây là môi trƣờng lỏng, đƣợc pha vào trong cốc khuấy tan, phân phối vào mỗi ống nghiệm 5ml, hấp ở 121oC trong 15 phút. Thành phần gồm:
Peptone 5g K2HPO4 5g Glucose 5g Nƣớc cất 1000ml Thuốc thử Methyl red Kovac’s - napthol 5% Dung dịch KOH 40%
3.2.3. Vật liệu nghiên cứu
Mẫu TP đƣợc sử dụng bao gồm các loại TP khác nhau đƣợc thu tại khu vực chợ và các quán ăn ven đƣờng, trong chợ và trong các quán ăn. Các loại mẫu thu đại diện cho 3 nhóm TP chính: TP ăn liền, TP tƣơi sống và TP khô. Chi tiết các loại mẫu đƣợc trình bày dƣới Bảng 3.1.
Bảng 3.1: Các nhóm thực phẩm đƣợc sử dụng trong khảo sát Nhóm mẫu TP Số lƣợng Loại mẫu Ăn liền 35
Xôi đậu xanh, xôi đậu bắp, chè chuối, chè đậu đen, chè đậu ván, chè đậu phộng, chè khoai sáp, nƣớc mía, nƣớc rau má, bánh plan, bánh canh, bánh bò, bánh bèo, bánh tiêu, bánh đậu xanh, đông sƣơng, bún, phở, bánh ƣớt, bánh bông lan, sữa đậu nành, chả chiên, chả hấp, chả lụa, tƣơng đen, tƣơng đỏ, nƣớc mắn, cá cơm kho khô, cá mai tẩm mè, cá bống mú tẩm , kim chi, cà chua ngọt, cải chua ngọt, đu đủ muối chua ngọt.
Tƣơi sống 21
Đậu phụ trắng, đậu phụ vàng, thịt heo, thịt gà, thịt bò, mực ống nguyên con, tép tƣơi, mực ống cắt khúc, cá mú đông lạnh, cá mập lụa đông lạnh, cồi điệp tƣơi đông lạnh, cá cờ đông lạnh, cá thu đông lạnh, cá trích đông lạnh, cá hố cắt khúc, cá nục đông lạnh, cá cơm đông lạnh , mực nang đông lạnh, nghêu lụa luộc đông lạnh, sò lông luộc đông lạnh, rau má, xà lách, cải xanh, tí tô.
Khô 24
Cá bò ép, tôm khô, cá mối khô, cá chỉ tẩm, nghêu luộc khô, sò hào khô, mực ống tẩm gia vị, cá cơm, cá trích, cá mối tẩm, cá hố khô, cá giãnh, cá úp giấy, tép khô, cá chỉ, cá bống mú tẩm, cá bò ép tẩm, cá thiều tẩm, cá bống mú khô, cá đuối khô.
3.3. Phƣơng pháp
3.3.1. Phƣơng pháp thu và bảo quản mẫu thực phẩm
Mẫu đƣợc thu tại chợ và đƣợc chứa trong bao nylon, bảo quản mẫu trong nƣớc đá cho tới khi vận chuyển về phòng thí nghiệm để phân tích. Nếu chƣa phân tích ngay thì đƣợc bảo quản trong tủ ở 4 – 5o
C trong 24 – 36 giờ. Riêng đối với mẫu cá và thủy sản tƣơi và khô thì đƣợc cán bộ Chi Cục thu tại cơ sở chế biến.
3.3.2. Phƣơng pháp pha loãng vi sinh vật
Cân 10 g mẫu cho vào 90ml dung dịch pha loãng SPW, sau đó đêm dập mẫu trong khoảng 30 giây, để đƣợc dung dịch pha loãng 10-1. Dùng micropipet với đầu típ vô trùng, hút 1 ml dịch mẫu vào ống chứa 9 ml dung dịch pha loãng, lắc đều đƣợc 10-2. Tiếp tục hút và pha loãng để đƣợc các nồng độ thấp hơn.
Hình 3.1: Sơ đồ pha loãng vi sinh vật 3.3.3. Phƣơng pháp phân tích tổng số vi khuẩn hiếu khí
Vi khuẩn hiếu khí là vi khuẩn sinh trƣởng và phát thiển ở nhiệt độ 30oC trong 72 giờ. Để xác định mậtc độ tổng số vi khuẩn hiếu khí, chúng tôi sử dụng bằng phƣơng pháp đổ đĩa.
Cách tiến hành
Sử dụng kẹp, kéo đã đƣợc vô trùng cắt và cân 10g ± 0,5g mẫu cho vào bao PE vô trùng, bổ sung vào 90 ml dung dịch pha loãng SPW đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong khoảng 30 – 40 giây để đƣợc độ pha loãng 10-1. Dùng micropipet với đầu típ vô trùng hút 1 ml dịch mẫu đã đƣợc pha loãng ở nồng độ 10-1 chuyển vào ống nghiệm chứa sẵn 9 ml dung dịch pha loãng để đƣợc 10-2, đồng nhất bằng máy lắc (vortex) rồi hút 1 ml chuyển vào hai đĩa petri trống vô trùng, sau đó hút 1 ml chuyển vào ống 9 ml dung dịch pha loãng, đồng nhất. Cứ tiếp tục hút cho đến khi đạt đƣợc độ pha loãng tùy theo mỗi loại mẫu phân tích.
Đổ môi trƣờng PCA vào các đĩa petri đã đƣợc cấy mẫu, mỗi đĩa khoảng 10 – 15 ml. Trộn đều dịch mẫu với môi trƣờng bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngƣợc chiều kim đồng hồ, mỗi chiều khoảng 3 – 5 lần, đặt môi trƣờng trên
90 ml 9ml 9ml 9ml 9ml 10g 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml Ống nuôi cấy ban đầu 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 Pha loãng ra các nồng độ tiếp theo Độ pha loãng
mặt phẳng nằm ngang cho môi trƣờng đông đặt lại, lật ngƣợc và ủ các đĩa trong tủ ấm ở nhiệt độ 30oC trong 72 giờ.
Tính kết quả
Sau thời gian ủ, chọn những đĩa có từ 25 – 250 khuẩn lạc để đếm. Tổng số vi khuẩn hiếu khí đƣợc tính theo công thức sau:
N A (CFU/g hay CFU/ml)
n1xV1xF1 +…+ nixVixFi
Trong đó: A: số đơn vị hình thành khuẩn lạc trong 1 g hay 1 ml mẫu. N: tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên các đĩa đã chọn. ni: số lƣợng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i.
Vi: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa Fi: độ pha loãng tƣơng ứng
3.3.4. Phƣơng pháp phân tích Coliforms tổng số
Để xác định mật độ Coliforms tổng số, chúng tôi tiến hành bằng phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống.
Cách tiến hành
Từ dịch pha loãng mẫu ở nồng độ ban đầu (10-1), hút 1 ml cấy chuyển vào đĩa petri vô trùng, mỗi nồng độ cấy 2 đĩa, thêm vào mỗi đĩa đã cấy khoảng 5 ml môi trƣờng TSA đã đƣợc hấp và đun tan, môi trƣờng này có tác dụng phục hồi các tế bào bị suy yếu hay bị tổn thƣơng trong quá trình chế biến cũng nhƣ trong thao tác mẫu. Sau đó trộn đều dịch mẫu với môi trƣờng bằng cách xoay tròn đĩa petri theo chiều kim đồng hồ, mỗi vòng xoay từ 3 – 5 lần, để yên từ 30 – 60 phút ở nhiệt độ phòng rồi bổ sung 10 – 15 ml môi trƣờng VRB, chờ đông đặc, lật ngƣợc và ủ các đĩa ở 37o
C ± 0,5oC trong 24 giờ.
Sau thời gian ủ, chọn đĩa có xuất hiện từ 10 – 100 khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ đậm, đƣờng kính lớn hơn 0,5 mm, có quầng tủa muối mật để đếm. Sau đó, dùng que cấy thẳng đã khử trùng chọn 5 khuẩn lạc cấy chuyển vào ống có chứa 5 ml môi trƣờng BGBL, ủ các ống ở 37oC ± 0,5oC trong 24 – 48 giờ.
Hình 3.2: Hình dạng khuẩn lạc Coliforms trên môi trƣờng VRB
Tính kết quả
Dựa vào số khuẩn lạc đếm đƣợc và tỷ lệ khẳng định, tính mức độ của
Coliforms theo công thức:
N
C (CFU/g hay CFU/ml) = x R
n xV x F
Trong đó: C: số Coliforms trong 1 g hay 1 ml mẫu
N: tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên đĩa đã chọn n: số lƣợng đĩa cấy tại độ pha loãng đã chọn V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa F: độ pha loãng tƣơng ứng
R: tỷ lệ khẳng định
3.3.5. Phƣơng pháp phân tích E. coli trong thực phẩm
Để xác định E. coli trong thực phẩm, chúng tôi dùng phƣơng pháp định tính, phƣơng pháp này chỉ cho phép phát hiện có hay không có E. coli trong mẫu thực phẩm.
Cách tiến hành
Bước tăng sinh chọn lọc: Đây là bƣớc rất quan trọng vì nó ức chế sự phát triển một số nhóm VSV không mong muốn.
Dùng micropipet vô trùng hút 1ml dịch pha loãng mẫu ở nồng độ ban đầu (10-1) cấy chuyển vào ống nghiệm có chứa 5ml môi trƣờng BGBL, lắc đều và ủ ở 44oC ± 0,5oC trong 24 – 48 giờ.
Bước phân lập: Bƣớc này nhằm tách biệt VSV mục tiêu ra khỏi quần thể của chúng. Dùng que cấy vòng đã khử trùng chọn những ống mẫu trong môi trƣờng BGBL có sinh hơi cấy phân lập sang đĩa môi trƣờng EMB, lật ngƣợc và ủ đĩa ở 37o
C ± 0,5oC trong khoảng 24 – 48 giờ.
Hình 3.3: Hình dạng khuẩn lạc E. coli trên môi trƣờng EMB
Bước khẳng định: Dùng que cấy vòng đã khử trùng chọn 5 khuẩn lạc dẹt, có ánh kim tím hoặc tím đen trên môi trƣờng EMB cấy vào đĩa môi trƣờng TSA, ủ ở 37o
C ± 0,5oC trong 24 – 48 giờ. Sau thời gian ủ, tiến hành thử sinh hoá theo nghiệm pháp IMViC: Indol (+), MR (+), VP (-), SC (-).
- Phản ứng Indol: Dùng que cấy vòng đã khử trùng, cấy chuyển sinh khối vi khuẩn từ môi trƣờng TSA sang ống có chứa 5ml môi trƣờng canh Trypton.
- Phản ứng MR - VP: Dùng que cấy vòng đã khử trùng, cấy chuyển sinh khối vi khuẩn từ môi trƣờng TSA sang hai ống có chứa 5ml môi trƣờng canh MR - VP.
- Phản ứng Simmoms Citrate (SC): Dùng que cấy thẳng đã khử trùng, cấy chuyển sinh khối vi khuẩn từ môi trƣờng TSA sang ống có chứa 5ml môi trƣờng SC.
Đem tất cả các ống đã cấy ủ ở 44o
C ± 0,5oC trong 24 giờ.
Hình 3.4: Các thử nghiệm sinh hóa IMViC
1: Thử nghiệm indol dương tính, 2: Thử nghiệm Indol âm tính, 3: Thử nghiệm MR dương tính, 4: Thử nghiệm MR âm tính, 5,6: thử nghiệm VP âm tính, 7,8: thử nghiệm
SC âm tính
3.3.6. Phƣơng pháp phân tích Staphylococcus aureus trong thực phẩm
Cách tiến hành
Dùng micropipet với đầu típ vô trùng, hút 0,2 ml dịch pha loãng mẫu ở nồng độ ban đầu (10-1) cấy vào đĩa petri có chứa 10 – 15 ml môi trƣờng thạch BP, dùng que cấy tam giác đã khử trùng cấy trãi đều trên mặt thạch cho đến khi nào khô, lật ngƣợc và ủ ở 37o
C ± 0,5oC trong 48 giờ.
Đọc kết quả
Chọn và đếm những đĩa có xuất hiện từ 10 – 100 khuẩn lạc có đƣờng kính từ 0,5 – 1 mm, tròn lồi, đen bóng có quầng sáng hoặc quầng trong xung quanh rộng khoảng 1 – 2 mm. Có một số dòng S. aureus không cho khuẩn lạc đặc trƣng.
Hình 3.5: Khuẩn lạc S. aureus trên môi trƣờng BP Khẳng định
Trên môi trƣờng BP chọn 5 khuẩn lạc đặc trƣng và 5 khuẩn lạc không đặc trƣng cấy vào môi trƣờng TSA, ủ ở 37oC ± 0,5oC trong 24 giờ, cấy chuyển sinh khối vi khuẩn từ môi trƣờng TSA vào ống nghiệm chứa 0,5ml huyết tƣơng tƣơi đông lạnh, ủ ở 37oC ± 0,5oC trong 24 giờ. Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tƣơng sau các khoảng thời gian 2, 4, 6, 8, và 24 giờ. Tính tỷ lệ khẳng định trên khuẩn lạc đặc trƣng và khuẩn lạc không đặc trƣng.
Kết quả phản ứng:
+ Dƣơng tính: có khối đông huyết tƣơng hình thành. Mọi mức độ đông huyết tƣơng đều cho là dƣơng tính.
+ Âm tính: không có khối đông, hỗn hợp vẫn đồng nhất nhƣ ống không
