Để xác định mật độ Coliforms tổng số, chúng tôi tiến hành bằng phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống.
Cách tiến hành
Từ dịch pha loãng mẫu ở nồng độ ban đầu (10-1), hút 1 ml cấy chuyển vào đĩa petri vô trùng, mỗi nồng độ cấy 2 đĩa, thêm vào mỗi đĩa đã cấy khoảng 5 ml môi trƣờng TSA đã đƣợc hấp và đun tan, môi trƣờng này có tác dụng phục hồi các tế bào bị suy yếu hay bị tổn thƣơng trong quá trình chế biến cũng nhƣ trong thao tác mẫu. Sau đó trộn đều dịch mẫu với môi trƣờng bằng cách xoay tròn đĩa petri theo chiều kim đồng hồ, mỗi vòng xoay từ 3 – 5 lần, để yên từ 30 – 60 phút ở nhiệt độ phòng rồi bổ sung 10 – 15 ml môi trƣờng VRB, chờ đông đặc, lật ngƣợc và ủ các đĩa ở 37o
C ± 0,5oC trong 24 giờ.
Sau thời gian ủ, chọn đĩa có xuất hiện từ 10 – 100 khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ đậm, đƣờng kính lớn hơn 0,5 mm, có quầng tủa muối mật để đếm. Sau đó, dùng que cấy thẳng đã khử trùng chọn 5 khuẩn lạc cấy chuyển vào ống có chứa 5 ml môi trƣờng BGBL, ủ các ống ở 37oC ± 0,5oC trong 24 – 48 giờ.
Hình 3.2: Hình dạng khuẩn lạc Coliforms trên môi trƣờng VRB
Tính kết quả
Dựa vào số khuẩn lạc đếm đƣợc và tỷ lệ khẳng định, tính mức độ của
Coliforms theo công thức:
N
C (CFU/g hay CFU/ml) = x R
n xV x F
Trong đó: C: số Coliforms trong 1 g hay 1 ml mẫu
N: tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên đĩa đã chọn n: số lƣợng đĩa cấy tại độ pha loãng đã chọn V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa F: độ pha loãng tƣơng ứng
R: tỷ lệ khẳng định
3.3.5. Phƣơng pháp phân tích E. coli trong thực phẩm
Để xác định E. coli trong thực phẩm, chúng tôi dùng phƣơng pháp định tính, phƣơng pháp này chỉ cho phép phát hiện có hay không có E. coli trong mẫu thực phẩm.
Cách tiến hành
Bước tăng sinh chọn lọc: Đây là bƣớc rất quan trọng vì nó ức chế sự phát triển một số nhóm VSV không mong muốn.
Dùng micropipet vô trùng hút 1ml dịch pha loãng mẫu ở nồng độ ban đầu (10-1) cấy chuyển vào ống nghiệm có chứa 5ml môi trƣờng BGBL, lắc đều và ủ ở 44oC ± 0,5oC trong 24 – 48 giờ.
Bước phân lập: Bƣớc này nhằm tách biệt VSV mục tiêu ra khỏi quần thể của chúng. Dùng que cấy vòng đã khử trùng chọn những ống mẫu trong môi trƣờng BGBL có sinh hơi cấy phân lập sang đĩa môi trƣờng EMB, lật ngƣợc và ủ đĩa ở 37o
C ± 0,5oC trong khoảng 24 – 48 giờ.
Hình 3.3: Hình dạng khuẩn lạc E. coli trên môi trƣờng EMB
Bước khẳng định: Dùng que cấy vòng đã khử trùng chọn 5 khuẩn lạc dẹt, có ánh kim tím hoặc tím đen trên môi trƣờng EMB cấy vào đĩa môi trƣờng TSA, ủ ở 37o
C ± 0,5oC trong 24 – 48 giờ. Sau thời gian ủ, tiến hành thử sinh hoá theo nghiệm pháp IMViC: Indol (+), MR (+), VP (-), SC (-).
- Phản ứng Indol: Dùng que cấy vòng đã khử trùng, cấy chuyển sinh khối vi khuẩn từ môi trƣờng TSA sang ống có chứa 5ml môi trƣờng canh Trypton.
- Phản ứng MR - VP: Dùng que cấy vòng đã khử trùng, cấy chuyển sinh khối vi khuẩn từ môi trƣờng TSA sang hai ống có chứa 5ml môi trƣờng canh MR - VP.
- Phản ứng Simmoms Citrate (SC): Dùng que cấy thẳng đã khử trùng, cấy chuyển sinh khối vi khuẩn từ môi trƣờng TSA sang ống có chứa 5ml môi trƣờng SC.
Đem tất cả các ống đã cấy ủ ở 44o
C ± 0,5oC trong 24 giờ.
Hình 3.4: Các thử nghiệm sinh hóa IMViC
1: Thử nghiệm indol dương tính, 2: Thử nghiệm Indol âm tính, 3: Thử nghiệm MR dương tính, 4: Thử nghiệm MR âm tính, 5,6: thử nghiệm VP âm tính, 7,8: thử nghiệm
SC âm tính
3.3.6. Phƣơng pháp phân tích Staphylococcus aureus trong thực phẩm
Cách tiến hành
Dùng micropipet với đầu típ vô trùng, hút 0,2 ml dịch pha loãng mẫu ở nồng độ ban đầu (10-1) cấy vào đĩa petri có chứa 10 – 15 ml môi trƣờng thạch BP, dùng que cấy tam giác đã khử trùng cấy trãi đều trên mặt thạch cho đến khi nào khô, lật ngƣợc và ủ ở 37o
C ± 0,5oC trong 48 giờ.
Đọc kết quả
Chọn và đếm những đĩa có xuất hiện từ 10 – 100 khuẩn lạc có đƣờng kính từ 0,5 – 1 mm, tròn lồi, đen bóng có quầng sáng hoặc quầng trong xung quanh rộng khoảng 1 – 2 mm. Có một số dòng S. aureus không cho khuẩn lạc đặc trƣng.
Hình 3.5: Khuẩn lạc S. aureus trên môi trƣờng BP Khẳng định
Trên môi trƣờng BP chọn 5 khuẩn lạc đặc trƣng và 5 khuẩn lạc không đặc trƣng cấy vào môi trƣờng TSA, ủ ở 37oC ± 0,5oC trong 24 giờ, cấy chuyển sinh khối vi khuẩn từ môi trƣờng TSA vào ống nghiệm chứa 0,5ml huyết tƣơng tƣơi đông lạnh, ủ ở 37oC ± 0,5oC trong 24 giờ. Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tƣơng sau các khoảng thời gian 2, 4, 6, 8, và 24 giờ. Tính tỷ lệ khẳng định trên khuẩn lạc đặc trƣng và khuẩn lạc không đặc trƣng.
Kết quả phản ứng:
+ Dƣơng tính: có khối đông huyết tƣơng hình thành. Mọi mức độ đông huyết tƣơng đều cho là dƣơng tính.
+ Âm tính: không có khối đông, hỗn hợp vẫn đồng nhất nhƣ ống không cấy.
Tính kết quả
Mật độ nhiễm S. aureus/g mẫu đƣợc tính theo công thức sau:
N
Mật độ(CFU/g hay CFU/ml) = x R
n x V x F
Trong đó: N: tổng số khuẩn lạc đặc trƣng đếm đƣợc trên đĩa n: số đĩa tại mỗi độ pha loãng đã chọn
V: thể tích dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa F: độ pha loãng
R: tỷ lệ đông tụ huyết tƣơng
3.3.7. Phƣơng pháp phân tích Salmonella trong thực phẩm
Cách tiến hành: qui trình phân tích đƣợc tiến hành qua 4 bƣớc
- Giai đoạn tiền tăng sinh: Cân 25 g mẫu cho vào bao PE vô trùng, bổ sung thêm 225 ml môi trƣờng nƣớc peptone đệm, cột miệng bao lại đem ủ ở 37oC trong 18 – 24 giờ.
- Giai đoạn tăng sinh chọn lọc: Lắc đều dịch vi khuẩn sau tiền tăng sinh,
lấy micropipet với đầu típ vô trùng hút 0,1 ml cấy chuyển vào ống nghiệm có chứa 10 ml môi trƣờng RV, ủ ở 42oC trong 24 giờ trong bể điều nhiệt.
- Giai đoạn phân lập: Sau khi ủ, lắc nhẹ dịch canh khuẩn sau tăng sinh chọn lọc dùng que cấy vòng đã khử trùng cấy ria sang đĩa môi trƣờng XLD, lật ngƣợc và ủ ở 37oC trong 24 giờ.
- Giai đoạn thử nghiệm sinh hóa: Trên môi trƣờng XLD chọn khuẩn lạc điển hình trong suốt, có tâm đen cấy sang đĩa môi trƣờng TSA, ủ đĩa ở 37oC trong 24 giờ. Từ môi trƣờng TSA cấy vào các môi trƣờng thử nghiệm sinh hóa sau:
+ Phản ứng KIA: Dùng que cấy thẳng đã khử trùng cấy chuyển sinh khối vi khuẩn từ môi trƣờng TSA, cấy đâm sâu xuống phần sâu của môi trƣờng KIA rồi ria đều trên bề mặt.
+ Phản ứng LDC: Dùng que cấy vòng đã khử trùng cấy chuyển sinh khối vi khuẩn từ môi trƣờng TSA vào ống có chứa 5 ml môi trƣờng LDC.
+ Phản ứng Mannitol: Cũng dùng que cấy vòng đã khử trùng cấy chuyển sinh khối vi khuẩn từ môi trƣờng TSA sang ống nghiệm có chứa 5 ml môi trƣờng Mannitol phenol red broth.
+ Phản ứng Urea: Cũng dùng que cấy vòng đã khử trùng cấy chuyển sinh khối vi khuẩn từ môi trƣờng TSA sang ống nghiệm có chứa 5 ml môi trƣờng Urea phenol red broth.
+ Phản ứng VP: Dùng que cấy vòng đã khử trùng cấy chuyển sinh khối vi khuẩn từ môi trƣờng TSA sang ống nghiệm có chứa 5 ml môi trƣờng MR – VP.
+ Phản ứng Indol: Dùng que cấy vòng đã khử trùng cấy chuyển sinh khối vi khuẩn từ môi trƣờng TSA sang ống nghiệm có chứa 5 ml môi trƣờng Canh Trypton.
Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Khảo sát mức độ nhiễm VSV chỉ thị chất lƣợng trong các loại thực phẩm
4.1.1. Mức độ nhiễm VSV chỉ thị chất lƣợng trong TP ăn liền
Thực phẩm ăn liền bao gồm tất cả các loại TP không qua giai đoạn chế biến hay gia nhiệt, chúng đƣợc sử dụng ngay khi mua về. Các loại TP này đƣợc bày bán trên khắp vỉa hè, đƣờng phố gồm nhiều loại: món ăn vặt, nƣớc uống, bánh phở, món ăn mặn, nƣớc chấm… Theo quy định số 3742/2001/QĐ-BYT của Bộ Y tế, ngƣỡng cho phép của chỉ tiêu VSV hiếu khí trong TP ăn liền nhỏ hơn hay bằng 104
CFU/g, chỉ số này mà vƣợt quá ngƣỡng cho phép thì không đạt chất lƣợng vi sinh.
Khảo sát đƣợc thực hiện trên tổng số 35 mẫu với các ngày thu mẫu khác nhau và đƣợc chia là 5 nhóm TP. Kết quả sau khi đƣợc tổng hợp và xử lý thống kê bằng chƣơng trình Excel (xem phụ lục B.1) đƣợc trình bày trên Bảng 4.1 và Biểu đồ 4.1.
Bảng 4.1: Kết quả kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí trong TP ăn liền
TPC(CFU/g) ln (TPC(CFU/g)) Nhóm ăn vặt 1,4 x 106 14,15 Nhóm nƣớc uống 2,8 x 105 12,54 Nhóm bánh phở 6,1 x 105 13,32 Nhóm ăn mặn 6,0 x 106 15,61 Nhóm nƣớc chấm 4,6 x 101 3,83 Tiêu chuẩn 104 9,21
Biểu đồ 4.1: Mức độ nhiễm tổng số vi khuẩn hiếu khí trong TP ăn liền
Kết quả thể hiện trên Bảng 4.1 và Biểu đồ 4.1 cho thấy, trong tổng số 35 mẫu TP ăn liền đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống có 10 mẫu đạt tiêu chuẩn cho phép và 25 mẫu không đạt, các mẫu không đạt thuộc trong các nhóm: nhóm ăn vặt, nhóm nuớc uống, nhóm bánh phở và nhóm ăn mặn. Trong đó hầu hết các mẫu TP thuộc nhóm nƣớc chấm đạt tiêu chuẩn về tổng số vi khuẩn hiếu khí. Kết quả này cho thấy trong các loại TP ăn liền đƣợc bày bán tại các chợ khu vực thành phố Phan Thiết có mức độ nhiễm tổng số vi khuẩn hiếu khí khá cao. Điều này khuyến cáo các nhà quản lý chất lƣợng vệ sinh TP cần phải có những biện pháp tăng cƣờng giám sát vệ sinh TP đang lƣu hành trên thị trƣờng, nhằm bảo đảm an toàn cho sức khỏe ngƣời tiêu dùng.
4.1.2. Mức độ nhiễm VSV chỉ chất lƣợng trong TP tƣơi sống
Thực phẩm tƣơi sống bao gồm tất cả các loại TP trƣớc khi sử dụng phải qua quá trình chế biến hay gia nhiệt, gồm các loại nhƣ: đậu phụ, thịt, rau, cá và các loại hải sản tƣơi sống,… Theo quy định số 3742/2001/QĐ-BYT của Bộ Y tế, ngƣỡng cho phép của chỉ tiêu tổng VSV hiếu khí trong TP tƣơi sống nhỏ hơn hay
bằng 106
CFU/g. Nếu trong TP có sự hiện diện của VSV này mà vƣợt quá ngƣỡng quy định thì không đảm bảo chất lƣợng an toàn vệ sinh TP.
Khảo sát đƣợc thực hiện trên tổng số 24 mẫu với các ngày thu mẫu khác nhau và đƣợc phân làm 5 nhóm: đậu phụ, thịt, cá đông lạnh, rau và các loại hải sản đông lạnh. Kết quả sau khi đƣợc tổng hợp và xử lý thống kê bằng chƣơng trình Excel (xem phụ lục B.2) đƣợc trình bày trên Bảng 4.2 và Biểu đồ 4.2.
Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí trong TP tƣơi sống TPC(CFU/g) ln (TPC(CFU/g)) Nhóm đậu phụ 2,5x106 14,73 Nhóm thịt 1,6x106 14,28 Nhóm cá đông lạnh 1,9x103 7,55 Nhóm hải sản đông lạnh 2,9x105 12,58 Nhóm rau 6,6x106 15,70 Tiêu chuẩn 106 13,82
Kết quả thể hiện trên Bảng 4.2 và Biểu đổ 4.2 cho thấy, trong tổng số 24 mẫu TP tƣơi sống đƣợc phân tích phát hiện 7 mẫu có chỉ số TPC cao hơn tiêu chuẩn cho phép và 17 mẫu đạt tiêu chuẩn, tỷ lệ mẫu không đạt là 29,2%. Trong đó nhóm đậu phụ 100% không đạt, nhóm thịt không đạt 2/3 mẫu và nhóm rau không đạt 2/4 mẫu. Riêng nhóm cá đông lạnh khảo sát 8 mẫu thì 100% đều đạt tiêu chuẩn với chỉ tiêu này, nhóm hải sản đông lạnh khác khảo sát 7 mẫu chỉ phát hiện 1 mẫu không đạt về chỉ tiêu TPC. Kết quả này cho thấy, trong các loại TP tƣơi sống đã phân tích, kể cả nhóm cá và hải sản đông lạnh nhìn chung đảm bảo an toàn về chỉ tiêu tổng VSV hiếu khí.
4.1.3. Mức độ nhiễm VSV chỉ thị chất lƣợng trong TP khô
Thực phẩm khô gồm các loại TP đã qua một lần xử lý nhƣng trƣớc khi sử dụng cũng phải qua quá trình chế biến lại nhƣ : cá khô, tôm, mực và các loại cá ép tẩm. Theo quy định số 3742/2001/QĐ-BYT của Bộ Y tế, ngƣỡng cho phép của chỉ tiêu VSV hiếu khí trong TP khô nhỏ hơn hay bằng 106CFU/g.
Khảo sát đƣợc thực hiện trên tổng số 21 mẫu với các ngày thu mẫu khác nhau và đƣợc phân làm 3 nhóm: nhóm cá khô, nhóm hải sản khô, nhóm cá ép tẩm. Kết quả sau khi đƣợc tổng hợp và xử lý thống kê bằng chƣơng trình Excel (xem phụ lục B.3) đƣợc trình bày trên Bảng 4.3 và Biểu đồ 4.3.
Bảng 4.3: Kết quả kiểm tra tổng VSV hiếu khí trong TP khô
TPC(CFU/g) ln (TPC(CFU/g))
Nhóm cá khô 1,1x106 13,91
Nhóm hải sản khô 7,7x105 13,55
Nhóm cá ép tẩm 2,7x105 12,48
Biểu đồ 4.3: Mức độ nhiễm tổng số vi khuẩn hiếu khí trong TP khô
Kết quả thể hiện trên Bảng 4.3 và Biểu đồ 4.3 cho thấy, trong tổng số 21 mẫu TP khô phân tích phát hiện 6 mẫu có chỉ số TPC cao hơn tiêu chuẩn cho phép và 15 mẫu nằm trong giới hạn, tỷ lệ mẫu không đạt chiếm 28,57%. Trong đó nhóm cá khô phân tích 8 mẫu phát hiện 3 mẫu có chỉ số TPC vƣợt quá ngƣỡng cho phép, còn nhóm hải sản khô phân tích 5 mẫu thì phát hiện 2 mẫu vƣợt quá ngƣỡng quy định, nhóm cá ép tẩm phân tích 8 mẫu thì chỉ có 1 mẫu không đạt. Qua kết quả trên cho thấy trong các loại TP khô thì nhóm cá khô phát hiện mức độ nhiễm TPC cao hơn hải sản khô và cá ép tẩm.
4.2. Khảo sát mức độ nhiễm VSV chỉ thị an toàn trong các loại thực phẩm 4.2.1. Mức độ nhiễm VSV chỉ thị an toàn trong TP ăn liền
Tham chiếu theo tiêu chuẩn số 3742/2001/QĐ – BYT của Bộ Y tế, quy định cho phép sự hiện diện của VSV chỉ thị an toàn trong TP ăn liền gồm: chỉ tiêu về Coliforms nhỏ hơn hay bằng 10 CFU/g và E. coli thì không cho phép có mặt. Nếu các chỉ tiêu này mà phát hiện trên mức cho phép chứng tỏ TP đó không an toàn về mặt vệ sinh TP.
Khảo sát đƣợc thực hiện trên tổng số 35 mẫu với các ngày thu mẫu khác nhau và đƣợc chia làm 5 nhóm chính: ăn vặt, nƣớc uống, bánh phở, ăn mặn và
nƣớc chấm. Kết quả sau khi tổng hợp và xử lý thống kê bằng chƣơng trình Excel (xem phụ lục B.1) đƣợc trình bày trên Bảng 4.4 và Biểu đồ 4.4
Bảng 4.4: Kết quả kiểm tra VSV chỉ thị an toàn trong TP ăn liền
Coliforms (CFU/g) ln Coliforms (CFU/g) Tỷ lệ nhiễm E. coli (%) Nhóm ăn vặt 1,3 x 103 7,17 (-12,99)-13,98 Nhóm nƣớc uống 6,1 x 102 6,41 0 Nhóm bánh phở 8,4x101 4,43 0 Nhóm ăn mặn 4,4x101 3,78 (-22,26)-27,32 Nhóm nƣớc chấm <1 0 0 Tiêu chuẩn 10 2,3 0
Biểu đổ 4.4: Mức độ nhiễm Coliforms trong TP ăn liền
Kết quả thể hiện trên Bảng 4.4 và Biểu đồ 4.4 cho thấy, trong tổng số 35 mẫu đã phân tích phát hiện 15 mẫu có mật độ Coliforms vƣợt quá ngƣỡng quy định, chiếm tỷ lệ 42,86%. Nếu xét riêng từng nhóm mẫu khác nhau thì nhóm ăn vặt phân tích 14 mẫu phát hiện 8 mẫu không đạt, nhóm nƣớc uống đã phát hiện cả 3/3 mẫu không đạt về chỉ tiêu này, nhóm bánh phở phát hiện 2/5 mẫu không
đạt và nhóm ăn mặn phát hiện 2/10 mẫu không đạt. Từ kết quả trên cho thấy rằng mức độ nhiễm Coliforms giữa nhóm ăn vặt cao hơn nhóm nƣớc uống, nhóm bánh phở và nhóm ăn mặn.
Các kết quả trên cũng cho thấy nếu tính chung trong tất cả các mẫu TP ăn liền đã phân tích thì tần số hiện diện của E. coli chiếm 8,57% (3/35). Nếu xét riêng tỷ lệ nhiễm E. coli trong từng nhóm mẫu khác nhau thì nhóm nƣớc uống,