III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.4. Phƣơng pháp nuơi cấy và thu sinh khối vi khuẩn Streptococcus sp.
dạng FKC (Formalin Killed Cell)
Phƣơng pháp nuơi cấy tăng sinh vi khuẩn
Dùng que cấy vịng đã khử trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống vi khuẩn gốc cấy lên đĩa mơi trường NA, ủ ở nhiệt độ phịng trong 24h. Đây là bước tăng sinh sơ khởi (tiền tăng sinh) để chọn được khuẩn lạc như mong muốn và số lượng cần thiết.
Chọn khuẩn lạc mong muốn cấy vào bình mơi trường NB. Nút chặt bình, nuơi cấy lắc ở nhiệt độ phịng trong 24h. Yêu cầu là bình nuơi cấy phải lớn để cĩ thể thu được sinh khối vi khuẩn mong muốn.
Phƣơng pháp tạo FKC
Sau 24 h nuơi cấy, mơi trường trở nên đục do vi khuẩn phát triển nhiều. Để kiểm tra sự tạp nhiễm, lấy mẫu cho lên lam kính, quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 40, xem xét hình thái đặc trưng của vi khuẩn và các vi sinh vật cĩ hình thái khác.
Dùng pipette hút dung dịch formalin 36% với số thể tích bằng 0,5% thể tích mơi trường cĩ trong bình (Theo Aasjord P. M. và Slinde E., 1994). Trộn đều, để qua đêm. Với nồng độ trên, formalin sẽ giết chết hết số vi khuẩn cĩ trong bình.
Đem li tâm huyền dịch vi khuẩn ở 6000 vịng/phút trong 20 phút. Hút bỏ phần nước nổi. Rửa lại bằng nước muối sinh lí 0,9% liên tiếp 3 lần để xả sạch hết formalin. Xác vi khuẩn thu được sẽ cĩ màu trắng, đựơc gọi là vi khuẩn dạng FKC. Số vi khuẩn thu được đem cân để xác định khối lượng, rồi pha lỗng bằng nước muối sinh lí để thu được huyễn dịch FKC cĩ nồng độ 10 mg/ml.
Để kiểm chứng vi khuẩn đã bị tiêu diệt hồn tồn, dùng que cấy vịng lấy một ít mẫu cấy từ bình nuơi NB đã cho formalin lên đĩa mơi trường NA, đem ủ ở nhiệt độ phịng. Quan sát sự xuất hiện khuẩn lạc vi khuẩn trong một tuần liên tục. Nếu khơng thấy bất kì khuẩn lạc xuất hiện thì vi khuẩn đã hồn tồn bị tiêu diệt.