Trong công nghiệp sản xuất sữa chua, các giai đoạn xử lí sản phẩm sau quá trình lên men thường đơn giản. Sản phẩm cuối cùng bao gồm cả sinh khối vi sinh vật, các sản phẩm trao đổi ngoại bào do vi sinh vật tiết ra và cơ chất sót. Thành phần và hàm lượng từng chất sẽ góp phần hình thành nên hương vị cho sản phẩm. Do đó, để sản xuất được sữa chua với chất lượng mong muốn, chúng ta cần phải:
- Chọn giống vi khuẩn thích hợp.
- Sử dụng môi trường lên men với thành phần cơ chất đầy đủ theo tỉ lệ tối ưu. - Lên men trong điều kiện thích hợp như: lượng giống cấy, nhiệt độ và thời gian lên men. Ngoài ra, ta còn phải quan tâm đến những vấn đề khác như việc cung cấp oxy, sự khuấy trộn…
Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm
Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm vi sinh thuộc khoa Công Nghệ Sinh Học trường Cao Đẳng Kinh Tế Công Nghệ số 547/M8 Nguyễn Tri Phương, Phường 14, Quận 10, Thành phố Hồ Chí Minh.
Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 03 đến tháng 07 năm 2009.
2.2. Nguyên liệu
Hạt đậu nành được chọn từ đậu nành Phương Lâm. Nguyên liệu được chọn mua siêu thị Nguyễn Văn Cừ, đường Võ Văn Ngân, quận Thủ Đức, Tp.HCM.
Sữa được chọn mua là sữa tiệt trùng không đường của Vinamilk, mua ở siêu thị Nguyễn Văn Cừ, đường Võ Văn Ngân, quận Thủ Đức, Tp.HCM
Tảo spirulina được chọn là bột tảo thương mại có nguồn gốc Nhật Bản, được đóng gói tại công ty Châu Đại Dương ( 79/3X Phan Tây Hồ, Phường 7, Quận Phú Nhuận, Tp.HCM), loại hộp 50g.
Đường được chọn mua là đương cát trắng tinh luyện, mua ở siêu thị Nguyễn Văn Cừ, đường Võ Văn Ngân, quận Thủ Đức, Tp.HCM.
Giống vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus của viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh. 2.3. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất sử dụng Dụng cụ Thiết bị Hóa chất 3Nhiệt kế 3Nồi nấu 3Bếp đun 3Vải lọc 3Ray
3Que cấy trải
3Khúc xạ kế ATAGO 0 – 32oBx
3Tủ sấy 3Cân điện tử 3Cân đồng hồ 3Máy xay sinh tố
3Môi trường MRS agar ( phụ lục)
3Môi trường MRS broth (Phụ lục)
3Cồn
3Đĩa Petri
3Bình tam giác có chia vạch
3Đũa thủy tinh
3Micropipette, đầu tip 3Buret
3Ống nghiệm
3Máy đồng hóa
3Tủ giữ lạnh của công ty Toshiba – Nhật Bản
3Tủ ấm( có thể chỉnh nhiệt độ thành tủ sấy) của công ty Membert- Đức.
3Nồi autoclave SA – 252F của công ty Sturdy – Đài Loan
3Tủ cấy của công ty Huy Hoàng – Việt Nam
3Máy đo pH pH211 của công ty Hanna – Italia
– Trung Quốc 3Phenoltalein 1% (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3Dung dịch NaOH 0,1N
2.4.Quy trình chế biến sữa chua đậu nành tảo Spirulina 2.4.1.Quy trình Đồng hóa Xử lý Dịch tảo Phối trộn Dịch sữa Xử lý Sữa UHT không đường Đường Lựa chọn Đậu nành Bột tảo
Cấy giống Nhân giống Thanh trùng Vi khuẩn lactic Rót hủ Bảo quản Sản phẩm Ủ 2.4.2.Giải thích quy trình
Lựa chọn đâụ nành: đậu được chọn thường là đậu già, ruột vàng, vỏ mỏng, da
láng. Loại bỏ những hạt hư hỏng ( sâu, mọt, mối...), hạt kém phẩm chất ( hạt non, hạt không bình thường về màu sắc và hình dạng...) do những hạt này sẽ làm cho sản phẩm có mùi vị rất kém.
Xử lý: Xử lý đậu nành để tạo ra dịch sữa bao gồm các công đoạn sau
3Ngâm: trong giai đoại ngâm, hạt sẽ hút nước và trương lên, khi đó các phân tử nước có tính lưỡng cực sẽ tác động lên các cấu phần ưa nước trong hạt.
Kết thúc giai đoạn ngâm là thời điểm độ ẩm hạt đạt 55 -60% là tốt nhất(Nguyễn Đức Lượng ,1996). Thời gian ngâm đậu được chọn là 4 giờ.
Giai đoạn ngâm còn giúp cho công đoạn loại bỏ vỏ trong điều kiện không có máy tách vỏ một cách dễ dàng hơn.
3Bóc vỏ: bóc vỏ bằng cách đãi thủ công trong nước. Bóc vỏ nhằm mục đích làm cho quá trình chần hiệu quả hơn và sữa đậu nành thu dược trắng hơn.
3Chần: chần nóng hạt đậu trong dung dịch Natribicarbonat nhằm loại bỏ yếu tố LOX ( lipoxigenase, là nguyên nhân gây ra mùi khó chịu), hổ trợ quá trình trương nở, ly trích protein, ức chế chất kháng dinh dưỡng. Chần dung dịch đậu trong dung
dịch NaHCO3 0,2% ở nhiệt độ 80OC trong vòng 5 phút. Tỉ lệ dung dịch/ đậu là 5/1. Sau khi chần, đậu được rửa lại bằng nước nóng 80OC.
3Xay và lọc: xay ướt đậu là quá trình phá vỡ tế bào giải phóng protein, lipit, gluxit v.v...đồng thời dùng nước hòa tan các chất và chuyển chúng sang dạng huyêng phù. Sau đó lọc huyền phù gồm dung dịch keo và chất rắn không tan thu dịch sữa. Xay đậu trong nước lạnh trong thời gian 1 phút 30 giây với tỉ lệ nước/đậu khi xay là 6/1. Sau khi xay đậu được lọc qua vải lọc.
3Xử lý nhiệt: được tiến hành ngay sau khi lọc hạn chế ảnh hưởng của sự tiếp xúc oxi không khí, ẩm, vi sinh vật.Gia nhiệt sữa đậu nành có các yêu cầu sau cần đạt: tiêu diệt vi sinh vật, diệt enzyme, diệt chất kháng dinh dưỡng, độc tố, khử mùi tanh đậu nành sống. Xử lý nhiệt ở 95OC trong vòng 15 phút.
Xử lý bột tảo: Bột tảo được cân và pha vào nước theo tỉ lệ 3g tảo / 50 ml nước
cất ấm ( khoảng 40- 50OC), lọc lấy dung dịch tảo bổ sung vào dịch sữa.
Phối trộn: Phối trộn sữa đậu nành, sữa tươi, dịch tảo, đường saccharose theo những tỉ lệ nhất định.
Trong quá trình thí nghiệm, tỷ lệ phối trộn giữa các thành phần như sau: dịch sữa là sự phối trộn giữa sữa đậu nành và sữa tươi với tỉ lệ 1:1, lượng dịch tảo bổ sung là 6% (v/v), lượng đường saccharose bổ sung là 6% (w/v), ngoài ra bổ sung thêm 5% gelatin dạng bột ( w/v).
Đồng hóa: nhằm tạo nên một hỗn hợp đồng nhất, đồng hóa ở tốc độ 4 trong vòng 5 phút.
Thanh trùng:thanh trùng ở 80OC trong vòng 15 phút.
Nhân giống vi khuẩn: Trước khi nhân giống ta phải làm thuần và giữ giống vi
khuẩn.
3Làm thuần giống là công việc tách rời một loại tế bào từ quần thể sinh vật đã được phân lập, cấy chúng lên bề mặt môi trường thạch dinh dưỡng chọn lọc (hoặc trộn thạch vào trước khi đông rồi đỗ ra đĩa Petri). Sau khi ủ ở các điều kiện thích hợp, các tế bào sẽ phân chia nhiều lần tạo thành những quần thể riêng biệt gọi là khuẩn lạc. Một ít tế bào trong khuẩn lạc được cấy vào ống môi trường giữ giống và ủ ở các điều kiện như trên để chúng phát triển thành một quần thể mới.Quần thể tế bào trong ống nghiệm này được gọi là một chủng hoặc ống giống.
Làm thuần và giữ giống được tiến hành như sau: Vi khuẩn trong ống giống mua từ viện Pastuer được cấy ria trên môi trường MRS agar,ủ ở 37oC trong tủ ấm 2 ngày cho đến khi thuần chủng, tiến hành giữ giống trong ống thạch nghiêng hoặc thạch sâu. 3Nhân giống:
Cấy giống: Cho vào dịch sữa men cái với tỉ lệ 10% ( Tỷ lệ giữa men L. acidophilus và L. Bugaricus là 1:1)
Ủ: Sữa được ủ ở 43OC trong thời gian khoảng 4- 8 giờ.
Bảo quản: Sản phẩm được bảo quản ở nhiệt độ 4OC.
2.5. Phương pháp thí nghiệm
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu quy trình chế biến sữa chua đậu nành tảo Sprirulina với tóm lược phương pháp nghiên cứu theo sơ đồ sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhân giống cấp 2 ( 1 sữa đậu nành + 1 sữa
UHT không đường) 10% giống, ủ 43oC, 6 giờ Men cái Nhân giống cấp 1 (MRS lỏng) ở 37oC, 15 giờ Giống vi khuẩn đã được làm thuần
Cho giống vi khuẩn làm quen môi trường sữa
Xây dựng đường cong sinh trưởng của vi khuẩn trên môi
trường MRS
Xây dựng đường cong sinh trưởng của vi khuẩn trong dịch sữa ( sữa tươi UHT và sữa đậu
nành).
Làm men cái
Khảo sát quá trình lên men
Khảo sát hàm lượng tảo bổ sung
Xác định các chỉ tiêu vi sinh và hóa học
Khảo sát thời gian bảo quản sản phẩm
Khảo sát thời gian lên men
Khảo sát hàm lượng đường saccharose bổ sung
Khảo sát tỉ lệ giống cấy Khảo sát tỷ lệ phối chế giữa sữa
tươi UHT và sữa đậu nành
2.5.1.Xây dựng đường cong tăng trưởng của Lactobacillus acidophilus,
Lactobacillus bulgaricus trên môi trường MRS.
a/ Mục đích
Xác định thời gian nuôi cấy tốt nhất để thu được số lượng vi khuẩn nhiều nhất.
0 5 10 15 20 Lactobacillus bulgaricus Lactobacillusacidophilus Vi khuẩn Thời gian (giờ)
c/Chỉ tiêu theo dõi
Số lượng vi khuẩn sau các khoảng thời gian nuôi trong môi trường MRS lỏng.
d/ Phương pháp thực hiện
- Giống vi khuẩn trong môi trường MRS agar cấy chuyền qua môi trường MRS lỏng, ủ ở 37OC trong các khoảng thời gian bố trí như trên.
-Số lượng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đổ đĩa.( Phụ lục 1.1)
2.5.2.Xây dựng đường cong tăng trưởng của Lactobacillus acidophilus,
Lactobacillus bulgaricus trên môi trường dịch sữa (sữa đậu nành và sữa tươi với tỷ lệ 1:1)
a/ Mục đích
Khảo sát số lượng vi khuẩn còn sống trong môi trường sữa sau các khoảng thời gian nuôi cấy, từ đó chọn ra khoảng thời gian nuôi cấy tốt nhất để thu được số lượng vi khuẩn cao nhất. b/ Bố trí thí nghiệm 0 5 10 15 20 Lactobacillus bulgaricus Lactobacillusacidophilus Vi khuẩn Thời gian (giờ) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
c/Chỉ tiêu theo dõi
Số lượng vi khuẩn sau các khoảng thời gian nuôi trong môi trường sữa đậu nành và sữa tươi với tỷ lệ 1:1.
d/ Phương pháp thực hiện
- Giống vi khuẩn trong môi trường MRS agar cấy chuyền qua môi trường MRS lỏng, ủ ở 37OC trong thời gian tối ưu.( ứng dụng kết quả thí nghiệm 2.5.1).
-Lấy vi khuẩn trong môi trường MRS lỏng cho vào môi trường sữa tươi không đường, ủ ở 37OC trong 4h.
-Vi khuẩn từ môi trường sữa tươi được cấy vào môi trường sữa tươi và sữa tiệt trùng phối trộn với tỷ lệ 1:1, ủ ở 37OC qua các khoảng thời gian và xác định số lượng vi khuẩn.
-Số lượng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đổ đĩa.
2.5.3.Làm men cái.
a/ Mục đích
Tạo ra hủ men đạt yêu cầu về số lượng vi khuẩn và giá trị cảm quan.
b/ Bố trí thí nghiệm
Xác định giá trị pH và đánh giá cảm quan sản phẩm qua bảng sau:
0 2 4 6 8 Lactobacillus bulgaricus Lactobacillusacidophilus Men cái vi khuẩn Thời gian (giờ)
c/ Chỉ tiêu theo dõi
-giá trị pH
-Đánh giá cảm quan sản phẩm về màu sắc, mùi vị, cấu trúc.
d/ Phương pháp thực hiện
-Vi khuẩn từ trong môi trường MRS lỏng được cấy chuyền qua môi trường sữa tươi UHT và ủ ở 43OC trong 4 giờ.
-Tiếp tục cấy chuyền vi khuẩn từ môi trường sữa tươi sang dịch sữa (sữa đậu nành và sữa tươi UHT với tỉ lệ 1:1), ủ ở 43OC trong các khoảng thời gian bố trí như trên.
2.5.4. Khảo sát quá trình lên men. 2.5.4.1. Khảo sát thời gian lên men. 2.5.4.1. Khảo sát thời gian lên men.
Chuẩn bị sữa đậu nành giống mục 2.4.2 và ứng dụng kết quả các thí nghiệm trên
Theo dõi pH, đặc điểm sản phẩm theo thời gian và kết hợp với đường cong sinh trưởng của vi khuẩn trong sữa đậu nành, từ đó chọn thời gian lên men thích hợp sao cho sản phẩm đảm bảo lượng vi khuẩn cần thiết để nó đóng vai trò như là probiotic
2.5.4.2. Khảo sát tỷ lệ phối chế giữa sữa đậu nành và sữa tươi tiệt trùng không đường. đường.
a/ Mục đích
Phối chế giữa sữa đậu nành và sữa tươi nhằm tạo ra dịch sữa tăng hàm lượng protein và làm cho sản phẩm sữa chua tạo ra có mùi thơm hơn, vị béo hơn.
b/ Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm một yếu tố gồm 3 nghiệm thức
Yếu tố thí nghiệm là tỉ lệ phối chế giữa sữa đậu nành và sữa tươi UHT như sau : 4:6, 5:5, 6:4.
Số lần lặp lại: 3 lần
c/ Chỉ tiêu theo dõi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
-pH của sản phẩm.
-Kết quả đánh giá cảm quan về cấu trúc, mùi và vị sản phẩm theo phương pháp so hàng.
d/ Phương pháp thực hiện
Mỗi thí nghiệm thực hiện theo quy trình đã nêu. Nhưng tỉ lệ phối chế giữa sữa đậu nành và sữa tươi UHT thay đổi theo các thông số đã nêu như trên.
2.5.4.3. Khảo sát hàm lượng đường saccharose bổ sung.
Chuẩn bị sữa đậu nành giống mục 2.4.2 và ứng dụng kết quả các thí nghiệm trên
Lần lượt bổ sung đường saccharose vào sữa theo các tỉ lệ khảo sát khác nhau 6%, 8%, 10%(w/v)
Theo dõi pH và đánh giá cảm quan sản phẩm theo phương pháp so hàng. Từ đó chọn hàm lượng đường thích hợp bổ sung vào sữa.
2.5.4.4.Khảo sát tỉ lệ giống cấy.
Chuẩn bị sữa đậu nành giống mục 2.4.2 và ứng dụng kết quả các thí nghiệm trên
Thay đổi tỉ lệ giống cấy tỉ lệ giữa Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus bulgaricus thay đổi như sau 6:4, 5:5, 4:6 (v/v).
Theo dõi pH và đánh giá cảm quan sản phẩm theo phương pháp so hàng. Từ đó chọn tỉ lệ giống cấy thích hợp bổ sung vào sữa để lên men.
2.5.5. Khảo sát tỉ lệ phối chế giữa dịch sữa ( sữa tươi UHT + sữa đậu nành) với dịch tảo spirulina. dịch tảo spirulina.
a/ Mục đích
Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tảo phối chế hưởng lớn đến màu, mùi và vị sản phẩm.
b/ Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm một yếu tố gồm 3 nghiệm thức
Yếu tố thí nghiệm là tỉ lệ phối chế giữa dịch tảo spirulina và dịch sữa (sữa đậu nành + sữa tươi UHT) với các tỉ lệ như sau:6%, 8%, 10%(v/v)
Số lần lặp lại: 3 lần
c/ Chỉ tiêu theo dõi.
-Kết quả đánh giá cảm quan về cấu trúc, màu, mùi và vị sản phẩm.
d/ Phương pháp thực hiện
Mỗi thí nghiệm thực hiện theo quy trình đã nêu. Nhưng tỉ lệ phối chế giữa dịch tảo và dịch sữa (sữa đậu nành + sữa tươi UHT) thay đổi theo các thông số đã nêu như trên. Ứng dụng kết quả các thí nghiệm trên.
2.5.6. Khảo sát thời gian bảo quản sản phẩm
Sản phẩm được bảo quản ở nhiệt độ 4OC
Theo dõi PH, độ acid và số lượng vi khuẩn lactic trong sản phẩm theo các ngày bảo quản để chọn ra được thời gian bảo quản tối ưu cho sản phẩm ( sản phẩm vừa đạt về giá trị cảm quan vừa đạt được giá trị dinh dưỡng về probiotic).
Sau thời gian bảo quản tối ưu, tiến hành đánh giá cảm quan sản phẩm theo phương pháp cho điểm thị hiếu nhằm xác định mức độ chấp nhận sản phẩm của người tiêu dùng.
2.6. Phương Pháp Phân Tích Các Chỉ Tiêu 2.6.1. Mật độ tế bào vi sinh vật: 2.6.1. Mật độ tế bào vi sinh vật:
Được xác định theo công thức sau:
Trong đó: C (CFU/g) là số tế bào vi khuẩn trong 1g mẫu n1xV1xf1 +…+ n1xV1xf1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
N C (CFU/g) =
N ( CFU) là tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa ni là số đĩa cấy ở nồng độ thứ i
Vi (ml) là thể tích mẫu cấy trong mỗi đĩa fi là độ pha loãng thứ i
2.6.2. Xác định pH của sản phẩm:
Đo bằng máy đo pH Hanna 210.
2.6.3. Phương pháp chuẩn độ acid
Cho 10ml sữa vào bình tam giác 100ml, sau đó cho vào khoảng 3 giọt
phenoltalein 1%. Dùng NaOH 0,1N chuẩn độ ( dung dịch xuất hiện màu hồng phấn trong 10 giây).
% acid= n. 0,09 n: số ml NaOH 0,1N
2.6.4. Phương pháp đánh giá cảm quan sản phẩm
3Phương pháp so hàng. ( phụ lục 1.3.1 ) 3Phương pháp cho điểm. (phụ lục 1.3.2 )
2.6.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý kết quả
3Bố trí thí nghiệm 1 yếu tố.
Chương 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Đường cong tăng trưởng của Lactobacillus acidophilus, Lactobacillusbulgaricus trên môi trường MRS broth bulgaricus trên môi trường MRS broth
4.1.1. Hình thái khuẩn lạc trên môi trường MRS agar
Hình 4.1: L. acidophilus Hình 4.2: L. bulgaricus
Khuẩn lạc L. acidophilus trên môi trường MRS agar có dạng hình tròn, kích thước 2 - 5 mm, lồi,màu trắng đục, đều và không sinh chất tạo màu.
Khuẩn lạc L. bulgaricus trên môi trường MRS agar phẳng, hơi vàng, đường kính 2 - 3mm.
4.1.2. Đường cong tăng trưởng của Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus trên môi trường MRS broth bulgaricus trên môi trường MRS broth
Chúng tôi tiến hành dựng đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Lactobacillus