c. Hình thái cấu trúc
3.5.3. Quy trình phân tích
Quy trình phân tích định tính Salmonell được mô tả ở hình 3.3
Hình 3.3: Quy trình phân tích định tính Salmonella
Ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 giờ
Kết luân: Phát hiện (hay không phát hiện) Salmonella trong 25g mẫu. Biểu hiện đặc trưng của Salmonella: trên TSI: đỏ/vàng/H2S(+)/Gas(+); Ure Broth(-), lên men mannitol(+), LDC both(+), thử nghiệm Indol(-), thử nghiệm Voges-Proskauer(-)
Cấy chuyển vào các môi trường thử nghiệm sinh hóa: môi trường TSI, Ure Broth, lên men mannitol, LDC both, thử nghiệm Indol, thử nghiệm Voges- Proskauer.
Cân 25g mẫu + 225 ml môi trường BPW đồng nhất 30 giây
Lấy 0,1ml mẫu trên vào 10ml môi trường RV
Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng để cấy sang môi trường TSA Ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 giờ
Ủ ở 42 ± 0,5oC trong 24 giờ
Cấy chuyển trên môi trường XLD và ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ Đem ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ
Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường XLD: tròn, lồi, trong suốt , có tâm đen đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm cả khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ.
3.5.4. Thuyết minh quy trình Chuẩn bị mẫu.
Dùng kéo vô khuẩn cắt 25g mẫu (không lấy mỡ, lấy cả chất lỏng nếu có), cho vào bao nilong vô khuẩn. Thêm vào 225ml môi trường PBW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu được độ pha loãng 10-1. Đem ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ.
Cấy mẫu.
Tăng sinh: Cấy 0,1ml dịch mẫu có nồng độ 10-1 vào ống nghiệm có chứa 10ml môi trường tăng sinh chọn lọc RV, Ủ ở 42 ± 0,5 oC trong 24 giờ.
Phân lập: Cấy mẫu từ môi trường RV sang môi trường thạch đĩa XLD
và ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Nhận dạng khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường XLD: tròn, lồi, trong suốt , có tâm đen đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm cả khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ (hồng)….
Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa TSA, tăng sinh không chọn lọc và ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 giờ
Thử nghiệm khẳng định.
Lấy khuẩn lạc từ môi trường TSA cấy sang các môi trường thử nghiệm sinh hóa. Thực hiện như sau:
• Thử nghiệm trên môi trường TSI:
-Hấp khử trùng môi trường TSI ở 1210C trong 15 phút và phân phối môi trường vào các ống vô trùng để làm ống thạch nghiêng.
-Dùng que cấy vòng cấy sinh khối từ khuẩn lạc của giống thuần sâu vào đáy của ống thạch nghiêng.
-Sau khi cấy xong thì ủ ở 370C trong vòng 24h – 48h.
-Salmonella chỉ lên men được đường glucose trong môi trường TSI phần nghiêng của môi trường TSI có màu đỏ, phần sâu có màu vàng.
-Salmonella có khả năng H2S xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường TSI.
-Có thể thấy hiện tượng sinh hơi qua hiện tượng làm vỡ thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy lên trên tạo ra một khoảng không bên dưới ống nghiệm.
• Thử nghiệm Urea Broth:
-Cấy VSV vào môi trường canh urea có chứa chất chỉ thị là bromocresol purple
-Ủ ở 370C trong khoảng 12h – 18h
Positive Negative
Hình 3.5: Thử nghiệm trên môi trường thạch TSI Negative
- Thử nghiệm(+): môi trường chuyển sang màu vàng. - Thử nghiệm(-): môi trường không đổi màu.
Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH môi
trường. Sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên màu tím.
• Lên men mannitol:
- Môi trường sử dụng là môi trường phenol red broth base có pH 7.4, chỉ thị môi trường này là phenol red có màu đỏ sẽ chuyển thành màu vàng khi pH < 6.8.
- Môi trường đã bổ sung đường được chứa trong bình tam giác được khử trùng bằng 1 trong 3 cách:
Lọc vô trùng qua màng lọc có kích thước 0.45 mm
Hấp 116 – 1180C trong vòng 15 phút( trừ lactose, saccharose, salicin, xylose, arabinose, trehalose, maltose ).
Hấp 1210C trong 15 phút.
- Sau khi khử trùng xong, để nguội và phân phối vào ống nghiệm. - Tiến hành cấy vào các ống môi trường các chủng VSV cần khẳng định. - Ủ 370C trong 18 – 24h.
Negative Negative
Negative
- Khả năng lên men của chủng được đánh giá dựa vào sự sinh acid và sinh hơi
- Sinh acid (+): môi trường màu cam chuyển sang vàng. - Sinh hơi (-): có bọt khí trong ống Durnham.
Môi trường sau khi nuôi cấy Salmonella bị acid hóa và chuyển thành màu vàng.
• Thử nghiệm LDC (Lysine Decarboxylase):
- Sử dụng môi trường Falkow .
- Tiến hành cấy vào các ống môi trường các chủng VSV cần khẳng định. - Chất chỉ thị màu trong môi trường là Bromocresol purple.
- Phản ứng (+): môi trường giữ nguyên màu tím ban đầu, canh khuẩn đục. - Phản ứng (-): môi trường từ tím chuyển sang vàng.
Sau khi nuôi cấy salmanella môi trường chuyển thành kiềm, môi trường giữ nguyên màu tím ban đầu.
Negative Positive Negative
• Thử nghiệm khả năng sinh Indol:
- Cấy VSV thử nghiệm qua môi trường canh trypton ủ khoảng 24 giờ ở 37oC.
- Nhỏ vài giọt ether để kéo indol lên bề mặt môi trường, thêm vài giọt thuốc thử Kovac’s
- Quan sát sau vài phút.
- Thử nghiệm (+): trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng màu đỏ cánh sen.
- Thử nghiệm (-): không xuất hiện vòng đỏ.
Negative
• Thử nghiệm Voges – Proskauer:
- Cấy vi sinh vật vào trong môi trường glucose phosphate (MR-VP Broth)
- Ủ ở nhiệt độ 370C trong vòng từ 2-5 ngày
- Thêm vào canh khuẩn dung dịch thuốc thử anpha- naphtol 5% trong cồn và dung dịch KOH 40% hay NaOH 40 %. với tỷ lệ 3:1.
- Quan sát phản ứng xảy ra trong 5 phút.
- Thử nghiệm (+):xuất hiện màu đỏ hay hồng sáng trên mặt môi trường.
- Thử nghiệm (-): môi trường không đổi màu.
Negative Negative
Positive