Yờu cầu về độ tin cậy của phộp phõn tớch

2. Ứng dụng của phương phỏp phổ hấp thu nguyờn tử trong thực phẩm :

2.1.3.4 Yờu cầu về độ tin cậy của phộp phõn tớch

a. éộ lặp lại của 2 lần bơm

éộ lệch chuẩn (CVs) tớnh theo độ hấp thụ của 2 lần bơm liờn tiếp của cựng một dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5%.

b. éộ thu hồi (R) éộ thu hồi được xỏc định bằng cỏch sử dụng 5 mẫu đó cho vào một lượng dung dịch thuỷ ngõn chuẩn biết chớnh xỏc nồng độ. éộ thu hồi tớnh được phải nằm trong khoảng từ 85% đến 115%, độ thu hồi trung bỡnh phải lớn hơn 90%.

2.1.5. Tớnh kết quả

Hàm lượng thuỷ ngõn trong mẫu thử thuỷ sản được tớnh theo cụng thức sau:

M

x

m

x

C

=10

²⁵⁰

- CHg là hàm lượng thuỷ ngõn cú trong mẫu thử (mg/g);

- mHg là hàm lượng thuỷ ngõn cú trong dung dịch mẫu tớnh được theo đường chuẩn (m g/l);

- V là thể tớch dung dịch dựng để hoà tan mẫu thử (ml); - M là khối lượng của mẫu thử (g).

2.2. Hàm lượng chỡ trong thủy sản2.2.1. Phạm vi ỏp dụng 2.2.1. Phạm vi ỏp dụng

Tiờu chuẩn này qui định phương phỏp xỏc định hàm lượng chỡ trong thuỷ sản và sản phẩm thuỷ sản bằng quang phổ hấp thụ nguyờn tử.

Tiờu chuẩn này được xõy dựng dựa theo phương phỏp chuẩn số 972.23 của Hiệp hội cỏc nhà hoỏ học phõn tớch (AOAC) cụng bố năm 1995.

2.2.3 Nguyờn tắc

Mẫu thuỷ sản sau khi được tro hoỏ trong lũ nung sẽ được hoà tan hoàn toàn bằng dung dịch axit clohyđric loóng. Chỡ trong dung dịch mẫu được xỏc định trờn mỏy quang phổ hấp thụ nguyờn tử.

2.2.4 Thiết bị, dụng cụ, hoỏ chất và chất chuẩn2.2.4.1.Thiết bị và dụng cụ 2.2.4.1.Thiết bị và dụng cụ

- Mỏy quang phổ hấp thụ nguyờn tử cú trang bị đốn catốt chỡ rỗng bước súng cài đặt là 283,3 nm, sử dụng ngọn lửa axờtylen-khụng khớ với chiều rộng của đầu đốt là 4 inch.

- Chộn sứ dung tớch 50 ml, độ sõu 5 cm hoặc cốc thuỷ tinh cú mỏ bằng thạch anh, dung tớch 100 ml.

- Tủ sấy nhiệt độ 1500 C.

- Lũ nung kiểm soỏt được nhiệt độ trong khoảng từ 250 đến 6000 C với sai lệch khụng quỏ 100 C.

- Dụng cụ thuỷ tinh đó được rửa sạch bằng axit nitric nồng độ 8N và trỏng lại bằng nước cất trước khi sử dụng.

- Cõn phõn tớch cú độ chớnh xỏc loại đến 0,01g và loại đến 0,0001 g.

2.2.4.2 Hoỏ Chất và chất chuẩn

- Dung dịch axit clohyđric (HCl), nồng độ 1N: Pha loóng 82 ml axit clohyđric đậm đặc bằng nước cất đến 1000 ml.

- Dung dịch axit nitric (HNO3) nồng độ 1N.

- Axit percloric (HClO4) đậm đặc, nồng độ 70,5 %. - ễxit lantan (La2O3).

- Ethylendinitrilotetraaxetat (sau đõy viết tắt là EDTA) - Dung dịch đệm

+ Cho 163 g EDTA vào trong bỡnh định mức 2000 ml, sau đú thờm 200 ml nước cất và một lượng vừa đủ hyđroxit amon (NH4OH) để hoà tan hết EDTA. Thờm 8 giọt chỉ thị methyl da cam vào dung dịch ETDA.

+ Cho 500 ml nước cất vào một cốc thuỷ tinh rồi từ từ cho thờm 60 ml dung dịch axit percloric đậm đặc, khuấy đều rồi để nguội. Sau đú, cho 50 g ụxit lantan vào cốc rồi khuấy đều để hoà tan hết lượng ụxit lantan này.

+ Rút từ từ dung dịch ụxit lantan vào dung dịch ETDA pha ở trờn, vừa rút vừa khuấy mạnh. Nếu cần thiết, thờm hyđroxit amon vào dung dịch trờn để giữ cho dung dịch cú tớnh kiềm đối với methyl da cam (dung dịch cú màu vàng). éịnh mức đến vạch bằng nước cất. - Dung dịch chỡ chuẩn

+ Dung dịch chuẩn gốc, 1,0 mg/ml

Hoà tan 1,5985 g nitrat chỡ chuẩn trong khoảng 500 ml dung dịch axit nitric nồng độ 1N. Sau đú, định mức thành 1000 ml bằng dung dịch axit nitric nồng độ 1N trong bỡnh định mức.

+ Dung dịch chuẩn trung gian, 10m g/ml

Lấy chớnh xỏc 10 ml dung dịch chuẩn gốc cho vào bỡnh định mức 1000 ml, thờm 82 ml dung dịch axit clohyđric nồng độ 1N vào bỡnh. Sau đú, định mức lờn bằng nước cất.

+ Dung dịch chuẩn làm việc

Pha loóng dung dịch chuẩn trung gian thành cỏc dung dịch chuẩn làm việc cú hàm lượng chỡ lần lượt là 0,0; 0,2; 0,6; 1,0; 3,0; 5,0 và 10,0 m g Pb/ml bằng dung dịch axit clohyđric nồng độ 1N trong cỏc bỡnh định mức dung tớch 50 ml.

2.2.5. Phương phỏp tiến hành2.2.5.1 Chuẩn bị mẫu trắng 2.2.5.1 Chuẩn bị mẫu trắng

Làm bay hơi 4 ml dung dịch axit nitric đậm đặc trong chộn sứ đến khụ trờn bếp cỏch thuỷ. Hoà tan cặn bằng 20 ml dung dịch axit clohyđric nồng độ 1N và chuyển dung dịch vào bỡnh định mức 25 ml. éể nguội bỡnh và định mức tới vạch bằng axit clohyđric nồng độ 1N. Chỳ thớch: Yờu cầu tổng hàm lượng chỡ trong mẫu trắng khụng được lớn hơn 10 m g.

2.2.5.2 Chuẩn bị mẫu thử

- Cõn khoảng 25,0 g mẫu cho vào chộn sứ rồi sấy khụ trong tủ sấy trong thời gian 2 giờ ở nhiệt độ từ 1350 C đến 1500 C. Chuyển chộn sứ vào lũ nung và tăng dần nhiệt độ đến 5000C. Giữ nhiệt độ lũ ở 5000 C trong thời gian 16 giờ để tro hoỏ mẫu.

- Lấy chộn sứ ra để nguội đến nhiệt độ trong phũng. Cho 2 ml axit nitric đậm đặc vào chộn rồi làm bay hơi dung dịch trong chộn vừa đến khụ trờn bếp cỏch thuỷ. éặt chộn sứ trở lại

vào lũ nung ở nhiệt độ thường, sau đú tăng dần nhiệt độ đến 5000 C và giữ ở nhiệt độ này trong khoảng 1 giờ.

- Lấy chộn ra, để nguội và lặp lại thao tỏc trờn cho đến khi tro cú màu trắng hoàn toàn. - Cho 10 ml dung dịch axit clohyđric nồng độ 1N vào chộn cú tro rồi hoà tan tro bằng cỏch đun núng. Chuyển gạn dung dịch vào bỡnh định mức dung tớch 25 ml.

- éun núng phần tro cũn lại trong chộn 2 lần, mỗi lần với 5 ml dung dịch axit clohyđric nồng độ 1N rồi rút dung dịch vào bỡnh định mức 25 ml núi trờn. éể nguội và định mức tới vạch bằng axit clohyđric nồng độ 1N rồi lắc đều.

2.2.5.3 Tiến hành phõn tớch

- Tối ưu hoỏ cỏc điều kiện làm việc của mỏy quang phổ hấp thụ nguyờn tử tại bước súng cộng hưởng 283,3 nm và đặt tốc độ dũng của hỗn hợp axờtylen-khụng khớ theo hướng dẫn của nhà sản xuất về điều kiện làm việc chuẩn đối với chỡ.

- Xõy dựng đường chuẩn với cỏc hàm lượng của chỡ lần lượt là 0,0; 0,2; 0,6; 1,0; 3,0; 5,0 và 10,0 m g/ml (4.2.7, c) dựa trờn độ hấp thụ của chỳng. Trong trường hợp tớn hiệu nhận được yếu, phải điều chỉnh độ khuyếch đại để cú được độ hấp thụ A của dung dịch chuẩn (hàm lượng 0,2 m g/ml) khụng nhỏ hơn 1 %.

- Khi đường chuẩn cú độ tuyến tớnh tốt, tiến hành đo độ hấp thụ của dung dịch mẫu thử và mẫu trắng đó chuẩn bị như sau:

+ éối với dung dịch mẫu thử trong, khụng cú cặn lắng

Tiến hành xỏc định độ hấp thụ 3 lần theo cỏc bước sau đõy: Bơm lần lượt một dung dịch chuẩn sau đú là dung dịch mẫu thử. Nếu số lượng mẫu nhiều thỡ bơm lần lượt một dung dịch chuẩn và 3 dung dịch mẫu thử cho đến khi bơm hết dung dịch chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng.

+ éối với cỏc dung dịch mẫu thử đục

Thờm 1 ml dung dịch đệm vào cỏc dung dịch mẫu thử đó và mẫu trắng đó chuẩn bị và cỏc dung dịch chuẩn. Sau đú, tiến hành xỏc định độ hấp thụ của cỏc dung dịch

- Tớnh hàm lượng chỡ trong mẫu thụng qua đường chuẩn sau khi đó trừ đi mẫu trắng.

2.2.5.4 Yờu cầu về độ tin cậy của phộp phõn tớch

éộ lệch chuẩn (CVs) tớnh theo độ hấp thụ của 2 lần bơm liờn tiếp của cựng một dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %.

- éộ thu hồi (R)

éộ thu hồi được xỏc định bằng cỏch sử dụng 5 mẫu đó cho vào một lượng dung dịch chỡ chuẩn biết chớnh xỏc nồng độ. éộ thu hồi tớnh được phải nằm trong khoảng từ 85 % đến 115 %, độ thu hồi trung bỡnh phải lớn hơn 90 %.

2.2.6 Tớnh kết quả

Hàm lượng chỡ trong mẫu thử thuỷ sản được tớnh theo cụng thức sau:

2.2.6.1 éối với dung dịch mẫu thử trong, khụng cú cặn lắng mPb mPb

CPb= --- x 25 M

2.2.6.2 éối với dung dịch mẫu thử đục phải bổ sung thờm dung dịch đệm Vđ 25 Vđ 25

CPb = mPb x --- x --- Vđ - 1 M

Trong đú:

- CPb là hàm lượng chỡ cú trong mẫu thử (m g/g);

- mPb là hàm lượng chỡ cú trong dung dịch mẫu tớnh được theo đường chuẩn (m g/ml); - 25 là thể tớch dung dịch axit clohyđric nồng độ 1N dựng để hoà tan mẫu (ml);

- Vđ là thể tớch dung dịch mẫu thử đó bổ sung 1 ml dung dịch đệm để phõn tớch (ml); - M là khối lượng mẫu thử (g).

2.3. Xác định hàm lợng As trong rau má và cải xanh bằng phơng pháp quang phổ hấp thu nguyên tử (AAs) hấp thu nguyên tử (AAs)

ở Việt Nam, vấn đề ô nhiễm asen (As) đang đe dọa sức khỏe hàng triệu ngời trong những năm qua. Kết quả phân tích mẫu nớc giếng khoan khu vực phía Bắc (Hà Nội, Hà

bằng sông Cửu Long, cũng phát hiện nớc ngầm của các tỉnh nh: An Giang, Đồng Tháp, Sóc Trăng.. có mức độ ô nhiễm As rất cao .

Độc tính và tính linh động của As phụ thuộc rất nhiều vào dạng hóa học của As. Trong khi As vô cơ là chất gây ung th thì As hữu cơ: monometyl asen (MMA) và dimetyl asen (DMA) là chất kích thích ung th , và độctính của dạng As(III) vô cơ thì cao hơn nhiều lần so với As(V) cùng loại ở cùng nồng độ . Vì vậy, việc xác định từng dạng riêng biệt của As trong mẫu thực phẩm rau là rất quan trọng, góp phần đánh giá một cách khoa học độc tính và nguy cơ gây hại của As cho sức khỏe con ngời qua nguồn thực phẩm.

Tách xác định trực tiếp dạng As bằng quang phổ hấp thi nguyên tử (AAS) liên hợp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) kết hợp xử lý bằng tia UV là phơng pháp phân tích hiện đại có độ chính xác cao và tin cậy cao đợc sử dụng trong nghiên cứu này.

2.3.1. Húa chất

Chất chuẩn As: NaAsO2 (As3+),Na2HAsO4.7H2O (As5+), DMA(C2H6AsO2Na) Fluka;MMA(CH3NaHAsO3) Sigma. Húa chất khỏc : metanol, NH4H2PO4 và

(NH4)2HPO4,K2S2O8, HCl, NaOH Merck.

2.3.2. Thiết bị :

Hỡnh : Sơ đồ phõn tớch liờn tục trực tiếp cỏc dạng As bằng kỹ thuật ghộp HPLC-UV-HG-AAS

2.3.3. Chuẩn bị mẫu phân tích

Rau má và rau cải xanh trồng trên đất ô nhiễm As (35 mg/kg), thu hoạch sau 45 ngày,mẫu đợc rửa sạch bằng nớc cất để loại bỏ đất và bụi bẩn. Dùng dao nhựa tách riêng phần rễ và phần lá, sấy khô 60oC trong 72 giờ. Tơng tự Nh vậy hai loại rau má và cải xanh cũng đợc trồng trên đất nền không ô nhiễm As để đối chứng.

Quy trình xử lý mẫu: (1) Vô cơ hóa mẫu bằng hỗn hợp axit HNO3:HCl (10:3), ở 165oC trong 5 phút trên thiết bị vi sóng (MarsX 5 plus, CEM, Mỹ). Định lợng hàm lợng As tổng trên thiết bị AAS kỹ thuật hydrua hóa. (2) Tách chiết dạng As dễ tan trong đất và rau [3]:

Chiết dạng As dễ tan trong đất bằng dung dịch H3PO4 0,5 M.

Chiết dạng As dễ tan trong mẫu rau bằng hỗn hợp dung môi metanol: nớc (1:1), ở nhiệt độ 75oC, trên thiết bị vi sóng (MarsX 5 plus, CEM, Mỹ).

Xác định dạng As dễ tan bằng kỹ thuật ghép HPLC-UV-HG-AAS.

2.3.4. Điều kiện phõn tớch dạng As bằng phương phỏp HPLC-UV-HG-AAS

HPLC: Cột tỏch sắc ký: Hamilton PRP- X100(250mm.4,1 mm i.d.10 m). Pha động A : 12 mmol/l KH2PO4- K 2HPO4; pH =6,5.B:2,4 mmol/l KH2PO4-K2HPO4; pH =6. Tốc đụ dũng pha động : 1ml/min. Húa hơi hidrit HG : Tốc độ HCl 4M : 1,6 ml/min ; Tốc độ K2S2O8: 1 ml/min; Tốc độ khớ mang Argon :50 ml/min. AAS :Bước súng 193,7 nm; khe sỏng : 5nm; Cường độ dũng đen catot rỗng :12mA

2.3.5. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

2.3.5.1. HPLC-UV-HG-AAS của cỏc dạng tồn tại của asen

Sau khi phõn tớch xỏc định thời gian lưu của từng chất chuẩn riờng biệt , tiến hành tỏch phõn tớch hỗn hợp 4 chất chuẩn As (III), As (V), DMA và MMA . Thứ tự giải hấp khỏi cột tỏch sắc ký tựy thuộc vào giỏ trị pKa và được kiểm soỏt bởi pH của pha động . Với cỏc điều kiện sắc ký như trờn cỏc dạng

của As sẽ bị rửa giải ra khỏi cột

theo thứ tự As3+, DMA, MMA và

As5+.

2.3.5.2. Dạng As trong rễ cõy rau mỏ và cải xanh rau mỏ và cải xanh

Để trả lời cho cõu hỏi As (V) từ đất bị hấp thụ bởi cõy trồng sẽ chuyển đổi dạng như thế nào? Tiến hành xỏc định dạng As trong rễ, lỏ rau mỏ và cải xanh. Kết quả phõn tớch trỡnh bày trong bảng

Bảng : dạng asen dễ tan trong rễ rau mỏ và cải xanh

Mẫu Dạng As(mg/kg) As3+ DMA MMA As5+ Rễ rau mỏ 1,70 KPH KPH 0,06 Rễ cải xanh 37,00 KPH KPH 6,64 KPH :Khụng phỏt hiện Cỏc thể hiện trờn sắc ký đồ ở hỡnh đó khẳng định chỉ cú As dạng vụ cơ trong rễ cõy và đó cú sự khử As(V) về As (III) trong rễ cõy rau. Kết quả cho thấy hàm lượng As(III)cao hơn As(V). Điều này cú thể giải thớch như sau: trong đất, As là một oxyanion AsO3-

4 đúng giả vai trũ của PO3-

4, cạnh tranh với photphat để đi vào trong rễ , nú được vận chuyển ngang qua màng huyết tương theo hệ thống vận chuyển photphat . Tại rễ, đó xảy ra quỏ trỡnh khử As trong rễ của hai loại rau này rất đỏng kể, cú đến 92% As trong rễ rau mỏ và 82% As trong rễ rau cải xanh ở dạng As(III) so với tổng lượng As được chiết bằng hỗn hợp dung mụi methanol/ nước.

Những kết quả thu được cũn cho thấy trong khi trong rễ rau mỏ hàm lượng As (III) cao gấp 28 lần As (V) , thỡ trong rễ cải xanh chỉ cao hơn 5 đế 6

thụ và tớch lũy As nhiều hơn rau mỏ . Điều đú chứng tỏ mức độ khử As (V) của rau cải thấp hơn so với rau mỏ . Tuy cú sự khỏc nhau như vậy nhưng quy luật trong rễ của hai loại rau này chủ yếu là As (III) vụ cơ.

2.3.5.3 Dạng As trong lỏ rau mỏ và cải xanh

Kết quả xỏc định dạng As trong lỏ rau mỏ và cải xanh trỡnh bày ở bảng: Bảng : dạng asen dễ tan trong lỏ rau mỏ và cải xanh

Mẫu Dạng As(mg/kg)

As3+ DMA MMA As5+

Lỏ rau mỏ ễ nhiễm 1,12 KPH KPH KPH

Đối chứng 0,16 KPH KPH KPH

Lỏ cải xanh ễ nhiễm 21,66 KPH KPH KPH

Đối chứng KPH KPH KPH KPH

KPH: khụng phỏt hiện

Từ kết quả phõn tớch cho thấy khụng phỏt hiện cú quỏ trỡnh metyl húa As trong lỏ rau mỏ và cải xanh nhằm làm giảm độc tớnh của As. Dựa vào kết quả phõn tớch cú thể dự đoỏn : hoặc đó cú sự khử hoàn toàn As(V) thành As(III) trong quỏ trỡnh As di chuyển từ rễ lờn lỏ . Hoặc chỉ cú As (III) di chuyển lờn lỏ

Để làm sỏng tỏ dự đoỏn trờn đó tiến hành xỏc định và so sỏnh lượng As dễ tan và tổng As cú trong cõy . Kết quả phõn tớch lượng As trỡnh bày ở bảng :

Mẫu As dễ tan Dạng khỏc Tổng As (HNO3/HCl)

ppm % ppm % ppm

Rau mỏ Lỏ 1,12 62 0,69 38 1,81

Cải xanh Lỏ 21,66 79 1,35 21 27,37

Rễ 43,64 88 1,63 12 49,48

Dạng khỏc = tổng As(HNO3/HCl)-As dễ tan.Từ kết quả trờn cho thấy , lượng As dễ tan trong rau mỏ thấp hơn với rau cải xanh ,cú khoảng 79 đến 88% As trong rau cải xanh là dạng dễ tan . Trong khi đú , rau mỏ chỉ cú từ 62 đến 80 %.Lượng As cũn lại ở những dạng khụng dễ tan chiếm từ 12 đến 38 % tựy từng loại.

2.3.5.4. kết luận

1. Asen tan trong dung dịch đất ở dạng vô cơ là As(V), chúng lan truyền từ môi trờng đất lên rau má và cải xanh trong quá trình sinh trởng.

2. Đã không phát hiện quá trình metyl hoá As trong đất và trong cây rau. As tích lũy trong