3.5.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của các chủng xạ khuẩn
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành tách chiết DNA từ 2 chủng xạ khuẩn là Đ1 và R2. Trước khi tiến hành tách chiết DNA, các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường tăng sinh để thu sinh khối tế bào.
-58-
được trình bày ở trên. Kết quả tách chiết được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 0,8% và được trình bày trong hình 3.13.
Đ1 R2
Hình 3.13. Ảnh điện di DNA tổng số của 2 chủng xạ khuẩn
Trên cơ sở kết quả thu được trong hình 3.13 cho thấy DNA đã được tách ra từ cả 2 chủng xạ khuẩn nêu trên. Tương ứng với mỗi chủng, sản phẩm điện di chỉ có một băng duy nhất đã chứng tỏ DNA không bị đứt gãy trong quá trình tách chiết. Hàm lượng DNA thu được là tương đối lớn và có độ sạch cao. Như vậy, có thể nói rằng DNA thu được trong quá trình tách chiết đã đạt được các yêu cầu đề ra. Sản phẩm DNA đáp ứng tốt cho các nghiên cứu khuếch đại gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR.
3.5.2. Kết quả nhân gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR
Để tạo tiền đề cho việc định loại 2 chủng xạ khuẩn đã được phân lập nêu trên, trong nghiên cứu này chúng tôi đã tiến hành khuếch đại gen 16S - rRNA. Đây là một gen chỉ thị được dùng phổ biến trong định loại VSV. Cặp mồi được thiết kế để khuếch đại cho phản ứng PCR cho phép khuếch đại trình tự trọn vẹn của gen 16S - rRNA, đảm bảo tốt cho các nghiên cứu tách dòng và
-59-
xác định trình tự đầy đủ của gen này. Kết quả khuếch đại gen được trình bày trong hình 3.14.
Hình 3.14. Ảnh điện di sản phẩm PCR của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu
M. Maker ΦX174 cắt bằng Hind III 3,4. chủng Đ1.
5,6. Chủng R2
Dựa trên kết quả điện di hình 3.14 cho thấy cả 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2 đều có sự nhân lên của gen 16S - rRNA. Sản phẩm PCR có độ đặc hiệu cao, không có các sản phẩm phụ. Mặt khác, dựa trên DNA maker chuẩn cho thấy sản phẩm PCR có kích thước khoảng 1,5 kb tương ứng với kích thước theo tính toán lý thuyết trong quá trình lựa chọn mồi. Như vậy có thể kết luận là đoạn DNA được nhân lên chính là gen 16S - rRNA. Kết quả này là cơ sở quan trọng để chúng tôi có thể tiếp tục tách dòng và xác định trình tự đầy đủ của gen 16S ở 2 chủng nghiên cứu.
-60-
Chƣơng 4
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN
1. Từ các mẫu đất khác nhau, đã phân lập và thuần khiết được 80 chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces, trong số đó có 30 chủng có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên chè ở các mức độ khác nhau, chiếm tỷ lệ 37,5%. Trong số các chủng có hoạt tính kháng nấm, nhóm trắng chiếm 36,7%, xám - 26,7%, xanh - 23,3%, hồng - 6,7%, nâu - 3,3%, lục - 3,3%.
2. Đã tuyển chọn được 2 chủng xạ khuẩn là Đ1 và R2 có hoạt tính mạnh nhất trong số 30 chủng có hoạt tính kháng nấm, kháng được cả 2 chủng nấm gây bệnh trên chè là CT - 2E và CT - 5X, đồng thời cũng có khả năng kháng các nấm kiểm định.
3. Đã tiến hành xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, khuếch đại gen 16S - rRNA để nhận định:
- Chủng R2 có thể là loài Streptomyces misawaensis. - Chủng Đ1 có thể là loài Actinomyces brunneofungus.
4. Đã xác định được một số điều kiện lên men thích hợp cho sự sinh tổng hợp CKS của 2 chủng xạ khuẩn.
- Môi trường A - 4H thích hợp cho lên men tạo chất kháng sinh cho cả 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2.
- Nguồn cacbon thích hợp nhất để tổng hợp CKS của chủng R2 là Sacarose và chủng Đ1 là glucose.
- Bột đậu tương và cao nấm men đều là những nguồn nitơ hữu cơ thích hợp cho lên men CKS của cả 2 chủng xạ khuẩn này.
-61-
4. 2. KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
1. Tiếp tục nghiên cứu để giải trình tự gene 16S của hai chủng xạ khuẩn Đ1 và R2.
2. Tiếp tục nghiên cứu khả năng tổng hợp CKS của hai chủng Đ1 và R2. 3. Tách chiết và xác định bản chất hóa học của các CKS.
4. Tìm hiểu khả năng ứng dụng của các CKS thô và cần được khảo nghiệm trên diện rộng để đánh giá hiệu quả sử dụng trong công tác bảo vệ thực vật.
-62-
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
Bùi Thị Hà, Vi Thị Đoan Chính (2008), "Khả năng kháng nấm gây bệnh trên chè của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Thái Nguyên", Tạp chí khoa học và công nghệ, số 2 (46), tr. 92 - 96.
-63-
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn (2006), Kỹ thuật trồng,chăm sóc và chế biến chè, NXB Nông nghiệp, tr. 72 - 77.
2. Ngô Đình Quang Bính (2005), Vi sinh vật học công nghiệp, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, Trung tâm khoa học Tự nhiên và công nghệ Quốc gia, Hà Nội, tr.53 - 71.
3. Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men các chất kháng sinh, NXB khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
4. Chi cục bảo vệ thực vật Phú Thọ, Sử dụng an toàn, hiệu quả thuốc bảo vệ thực vật trên cây chè, 07/2003, tr. 24 - 30.
5. Nguyễn Hoàng Chiến (2000), Nghiên cứu chủng xạ khuẩn
Streptomyces V6 sinh chất kháng sinh chống vi khuẩn gây bệnh héo xanh cà chua, Luận văn thạc sĩ sinh học, Hà Nội.
6. Vi Thị Đoan Chính (2000), Nghiên cứu khả năng nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng Streptomyces rimosus R77 và Streptomyces hygroscopicus 5820 bằng kỹ thuật dung hợp tế bào trần, Luận án TS sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội.
7. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học - Tập III. NXB khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 8. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng
Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập I, NXBKHKT Hà Nội, 328 - 345.
9. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Nguyễn Đình Quyến (1977), Vi sinh vật học - tập II, Nhà xuất bản Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội.
-64-
10. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo Dục, Hà Nội, tr. 39 - 41.
11. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Nữ Kim Thảo, Các nhóm vi khuẩn chủ yếu, Vietsciences, 15/02/2006
12. Nguyễn Thành Đạt(2000), Sinh học vi sinh vật, NXB Giáo dục
13. Nguyễn Thành Đạt, K.A. Vinogradva V.A.Poltorac (1974), Tính biến dị bề mặt bào tử Xạ khuẩn sinh choromomycin, Act.A. buraviensis, microbiologia, TXL III, N5, NXB Academia cccp.
14. Bùi Thị Việt Hà (2006), "Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam", Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội.
15. Đỗ Thu Hà (2004) Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Quảng Nam-Đà Nẵng, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội.
16. Lê Gia Hy (1994), "Nghiên cứu Xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn và thối cổ rễ phân lập ở Việt Nam", Luận án Tiến sĩ, Hà Nội.
17. Lê Gia Hy, Nguyễn Quỳnh Châu, Phạm Kim Duy, "Ảnh hưởng của canxi và coban lên khả năng sinh tổng hợp clotetraxyclin và vitamin B12 bằng phương pháp lên men bề mặt", Tạp chí sinh học, số 4, 1992. 18. Lê Gia Hy và cộng sự (1992), "Tính đối kháng của xạ khuẩn phân lập từ
đất Việt Nam đối với bệnh đạo ôn", Tạp chí Sinh học, tập 14, số 4, 11 - 12. 19. Lê Mai Hương (1993), Nghiên cứu Xạ khuẩn sinh chất kháng sinh
phân lập ở Hà Nội và vùng phụ cận, luận án tiến sĩ, Hà Nội.
20. Biền Văn Minh (2000), Nghiên cứu khả năng sinh chất kháng sinh của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Bình Trị Thiên, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội.
-65-
21. Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật, NXB Xây dựng, Hà Nội, tr.47-49.
22. Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất bản xây dựng, Hà Nội, tr.47 - 49.
TIẾNG ANH
23. Berdy,J. (1974), "Recent development in antibiotic research and classification of antibiotic according to the chemical structure", Adv. Appl.Microbiol, 18. 309 - 406.
24. Demain. A.L.A. (1974), "How do antibiotic - producing microorganism avoid suicide" Annuals of the New York academy of science, 235, 601-602.
25. Demain. A.L.A - Fang (1995) "Emerging concept of secondary metabolism in actinomycetes", J. Actinomycetologica, 9, 98 - 117.
26. Furimai,T,K.Saitoh, M.Kakushima, S.Yamamuto, K.Suzuki,
C.Ikeda,S. Kobaru, M.Hatori and T.Oki, BSM - 181184, A new pradimicins deverative, J. Antibiotics 1993, N046 (2), p - 265 - 274. 27. Goldat S. iu., 1958, Antibiotiki, N4, p.14-18.
28. Hamada M., Okami Y. 1968c. In: Sazaki M., Hara T., Takeuchi T. et al. J. Antibiot., A 21, p. 37-44.
29. Hopwood D.A and MJ. Merrick, (1997), "Genetics of antibiotic production" , J. Bacteriol, pp. 596 - 636.
30. Jongsik Chun, Seung. B.K, youn Kyung Oh, Goodfellow. M (1999), "Amycolatopsis thermoflava sp.nov, anovel soil actinomycete from Hainan Island, China", Int. J, Syst. Bacteriol - 49, 1369 - 1373.
31. Martin, J. F, A.L. Demain, (1980), "Control of antibiotics synthesis",
-66-
32. Miyadoh S. (2001), Identification manual of Actinomycetes, Business Center for Academic Scieties Japan.
33. Newman D.J, Cragg G.M, Snader K.M, (2003), Natural products as ourees of new drugs over the period", J Nat Prod, 66, 1022 - 1037. 34. Porter. N, (1995), "Culture conditional for antibiotic - producing
icroorganisms", Methods in enzymol, XVIII, 3 - 23.
35. Robert D. Nolan, Thomas C (1988), "Isolation and Screeming of Actinomycetes". In Actinomycetes in Biotechnology, Academic Press, london. 36. Sezaki M, Miyadoh S, (2001), "Practically used Antibiotics and their
related substances", In Indentification Manual of Actinomycetes, Japan. 37. Shirling E.B, Gotilieb D. (1966), " Methods for characterization of
Streptomyces spectes", International Journal of Systematic Bacteriology, Vol 16, No 3, 313 - 340.
38. Shirling E.B, Gotilieb D, "Cooperative deription of type cultures of
Streptomyces" V.Additional descriptions, International journual of systematic Bacteriology Vol 22, 1972, p.265 - 394.
39. Tobias Kieser, Mervyn Bibb, Mark J. Buttner Keith F. Chater, David A, Hopwood (2000), Practical Streptomyces genetics, The John Innes Foundation Norwich, p.170 - 171.
40. Tong chai. K, Phuripun.L, Charan, C (1995), Antibiotic Production of Actinomycetes in Forest Termite Soil, 20 - 40.
41. Tresner. H. D, M. C. Davies, and E. Jackus, (1961), "Electron icroscopy of Streptomyces spore morphology and its role in species ifferentiation". J. Bacteriol. 81, 70 - 80.
42. Trerner, H.D, Buckus. E.J (1963), "System of color wheels for Streptomyces taxonomy" Appl. Microbiol, 11, 335 - 338.
-67-
43. Waksman, S. A. (1961) The Actinomycetes. Classification,
identification and descriptions of genera and species, vol 2, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA.
44. Williams and Wilkin, Bergey's maunual of systematic Bacteriology, Vol 4, 1989, pp. 2451 - 2492.
45. Werner Braun (1976), Di truyền học vi khuẩn (Người dịch Lê Đình Lương), NXB khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
46. Weinberrg E.D (1973), Secondary metabolism Control by temperature and inorganic photphate, Ind. Microbiol 15, 1 - 14.
47. Yoo JC, Kim JH, Ha JW, Park NS, Sohng JK, Production and biological activity of laidlomycin, anti - MRSA/ VRE antibiotic from
streptomyces sp, CS684, J Microbiol, 2007/ 2, 45 (1): 6 - 16. TIẾNG NGA 48. Н.А. Красилников (1971) Лучитые Грибки. Издательство «Наука», Москва. 49. Г. Ф. Гаузе, Т.П.Преображенская, М. А. Свешникова, Л.П.Терехова,Т.С.Максимова,(1983),Определитель Актиномицетов. Издательство «Наука», Москва. 50. http://www.vietnamgateway.org