3. Nội dung nghiên cứu
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Các phƣơng pháp hóa sinh
2.3.1.1. Phương pháp xác định tỷ lệ lòng trắng, tỷ lệ lòng đỏ
Sử dụng phương pháp cân bằng cân kỹ thuật có độ chính 10-4, xử lý số liệu trên máy vi tính.
2.3.1.2. Phương pháp xác định hàm lượng nước
Cân 3 mẫu trứng (lòng đỏ, lòng trắng, vỏ) của mỗi giống trên cân điện tử rồi cho vào tủ sấy ở 60o
C trong 3 - 5 ngày, sau đó lấy mẫu ra cân lại cho tới khi khối lượng không đổi.
Hàm lượng nước được tính theo công thức: N = t k 100
t
P P
P %
Trong đó: N: Hàm lượng nước (%) Pt: Khối lượng mẫu tươi (g) Pk: Khối lượng mẫu khô (g)
2.3.1.3. Định lượng lipid tổng số
Định lượng lipid tổng số theo phương pháp chiết bằng petroleum ether và cân trọng lượng đầu và cuối [13].
Nguyên tắc: Dựa vào tính hoà tan của lipid trong dung môi hữu cơ (ete, benzen, chloroform...) để chiết rút lipid ra khỏi nguyên liệu.
Tiến hành: Cân 0,05g mẫu đã sấy khô tuyệt đối nghiền nhỏ cho vào tube, cho 1,5 ml petroleum ether vào ống đã chứa mẫu, lắc đều trên máy Vortex 15 phút. Tiến hành chiết 3 lần.
Chiết lần 1: Mẫu cho vào 3 tube đổ dung môi hữu cơ theo mức quy định để vào tủ lạnh nhiệt độ 4oC trong 24 giờ, li tâm 12000 v/p, loại bỏ dịch.
Chiết lần 2: Cho petroleum ether vào theo mức quy định, để vào tủ lạnh ở nhiệt độ 4o
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chiết lần 3: Cho petroleum ether vào theo mức quy định để vào tủ lạnh độ 4oC trong 8 giờ, li tâm 12000 v/p, loại bỏ dịch.
Lấy vài giọt dịch chiết lên lam kính hơ nhẹ cho petroleum ether bay hết, soi lên kính. Nếu thấy lam kính trong suốt chứng tỏ mỡ trong mẫu đã hết. Sấy khô các tube đã chiết ở nhiệt độ 105oC, cân đến khối lượng không đổi.
Tính kết quả hàm lượng lipid được tính theo công thức: L = A B 100
A %
Trong đó: L: Hàm lượng lipid (%)
A: Khối lượng mẫu ban đầu (g)
B: Khối lượng mẫu sau khi chiết lipid (g)
2.3.1.4. Định lượng Protein (theo phương pháp Lowry)
Nguyên tắc của phương pháp: Dựa vào sự hình thành phức chất đồng và protein (phản ứng Biure). Chất này tác động với thuốc thử folin cho màu đặc trưng cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng protein. Phức chất màu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 750nm.
Thuốc thử folin có tác dụng với gốc Tyr, Trp, His trong phân tử protein để tạo nên phức chất màu. Ngoài ra cường độ màu của phức chất có thể tăng lên trong môi trường phản ứng có chứa muối amôn, vòng imidazol, phenol, pirimidin, axit uric, các ion kim loại hoặc các hợp chất chứa nhóm - SH, các axit tự do Tyr, Trp. Hoặc cường độ màu của phức chất có thể bị giảm khi có mặt của etanol, ete ở nồng độ cao hơn 5%; axeton; Ba(OH)2 ở nồng độ hơn 1%, axit Cl3COOH, hay HClO4. Vì vậy để đạt cường độ màu chính xác dung dịch protein với thuốc thử folin phải được tinh sạch.
Phương pháp Lowry có độ nhạy tương đối cao, cho phép xác định dung dịch chứa mẫu vài chục g protein. Vì vậy phương pháp này được áp dụng khá phổ biến với các mẫu đã loại bỏ các chất gây tác động tăng hoặc giảm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn cường độ của phức chất với thuốc thử folin. Tuy nhiên phương pháp này không dùng để định lượng các protein không chứa vòng thơm.
Cách tiến hành: Chuẩn bị dung dịch C và dịch chiết protein, cho vào mỗi ống nghiệm 2,5ml dung dịch C + 1.5ml H2O + 0,5ml mẫu + 0,5ml folin để 30' đem đo trên máy quang phổ bước sóng 750nm.
Ống đối chứng 2,5ml dung dịch C + 1.5ml H2O + 0,5ml folin
Sử dụng máy quang phổ để đo mật độ quang, lập đồ thị chuẩn: Pha dung dịch protein 0,02% từ dung dịch gốc albumin tiêu chuẩn 0,1% pha 5 lần được dung dịch albumin có khối lượng 0,2mg/ml.
Tính kết quả: Kết quả trên máy quang phổ xác định được khối lượng
protein trong 0,25ml dung dịch mẫu thí nghiệm (mg/ml). Từ đó tính hàm lượng protein trong nguyên liệu (%) theo công thức:
% protein = 100%
g P a
Trong đó: a: số đo trên máy quang phổ P: hệ số pha loãng (200) g: số mg mẫu cần phân tích
2.3.1.5 Phương pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu thu được theo phương pháp thông kê sinh học trên máy vi tính bằng chương trình Excel [6] với các thông số:
Giá trị trung bình X n X X n 1 i i Độ lệch chuẩn SX ) 30 ( 1 ) 30 ( 1 2 1 2 n n X X S n n X X S n i i X n i i X
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Sai số trung bình mX ) 30 ( 1 ) 30 ( n n S m n n S m X X X X
2.3.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử
2.3.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật
Nguyên tắc chung
Màng tế bào được phá vỡ bằng các chất tẩy mạnh, DNA trong và ngoài nhân được giải phóng cùng với các protein. Sau đó DNA được tinh sạch nhờ proteinase K và phenol trong hỗn hợp phenol:chloroform:isoamylalcohol. Cuối cùng, DNA được tủa bằng cồn 100% và thu lại bằng phương pháp ly tâm.
Quy trình kỹ thuật
Làm tan máu đông lạnh ở 37- 39oC trong bể ổn nhiệt khoảng 1 giờ, chia máu vào các ống eppendorf 1,5ml với thể tích 500 l/ống, tách chiết DNA tổng số theo phương pháp của Sambrook và Russell [28] các bước như sau:
Bước 1: Hoà tan 500 l máu với 500 l PBS vortex và ly tâm ở 6000 v/p, 15 phút, 4ºC, đổ dịch, thu cặn.
Bước 2: Thêm 1ml dung dịch đệm tách (buffer lysis) và 10 m proteinase K. Mẫu được ủ ở 65ºC trong 1h, sau đó để ở nhiệt độ phòng, chia vào mỗi ống Epp 500 l dịch.
Bước 3: Bổ sung một lượng tương đương Phenol:Chlorofom:Isoamyl alcohol (tỷ lệ 25:24:1), vortex kỹ, sau đó ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4ºC. Hút pha trên vào ống mới.
Bước 4: Thêm một thể tích tương đương Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1), vortex và ly tâm ở 12000 v/p, 15phút, 4ºC. Thu pha trên.
Bước 5: Thêm CH3COONa một lượng bằng 1/10 thể tích dung dịch trong ống. Thêm 3 thể tích cồn 100%, để ở tủ lạnh -20º trong 15h (qua đêm).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bước 6: Ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4ºC để thu DNA. Tiếp đó, bổ sung 500 l cồn 70% để rửa, ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4ºC, bỏ dịch và thu cặn.
Bước 7: Làm khô cặn trong máy sấy, hoà tan cặn trong 50 l H2O, búng nhẹ.
2.3.2.2. Kĩ thuật điện di DNA trên gel agarose
Nguyên tắc chung
Điện di là kỹ thuật dùng để tách và định lượng axit nucleic với các kích thước và hàm lượng khác nhau. Kĩ thuật này dựa trên một đặc tính cơ bản của axit nucleic là các đại phân tử tích điện âm do sự có mặt của gốc PO43-
trên bề mặt. Do đó, khi đặt axit nucleic trong điện trường với cường độ dòng và hiệu điện thế thích hợp, chúng sẽ di chuyển dần về phía cực dương. Gel được sử dụng trong kỹ thuật điện di có thể là gel agarose hoặc polyacrylamid. Trong thí nghiệm này, chúng tôi đã dùng gel agrose 0,8 % bởi nồng độ này phù hợp với kích thước trung bình của các đoạn DNA cần phân tích (1 - 20kb).
Quy trình kỹ thuật
Chuẩn bị gel agarose: Cân 0,8g agarose vào 100ml dung dich đệm TAE. Đun trong lò vi sóng cho đến khi thu được dung dịch trong suốt. Để nguội đến khoảng 50 - 60ºC, đổ dung dịch agarose vào khay đã cài sẵn răng lược. Sau 30 phút gel đông lại thì rút răng lược ra và đặt bản gel vào bể điện di có chứa dung dịch đệm TAE.
Tra mẫu DNA: Trộn một lượng mẫu thích hợp (3 l) với đệm tra mẫu (2,5 l), tra vào các giếng trên bản gel. Điện di với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 100V, dòng 60 - 80mA trong khoảng 30 phút.
Sau khi kết thúc điện di, lấy bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 0,5 l/ ml. Lấy bản gel ra sau 10 -15 phút và rửa trong nước sạch.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.3.2. 3. Nhân vùng điều khiển D-loop bằng kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR do Mullis và cộng sự phát minh năm 1998. Từ đó đến nay Kỹ thuật PCR được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã có những đóng góp đáng kể cho những tiến bộ về sinh học phân tử [21].
Nguyên tắc chung
Trong kỹ thuật PCR, người ta sử dụng enzym DNA Taq polymerase đã được phân lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus để tổng hợp DNA trong môi trường phản ứng có chứa 4 loại deoxynuleotide (dNTPs) cùng các cặp mồi chuyên biệt. Mồi được sử dụng ở đây là các oligonuleotide có khả năng kết cặp với một đầu của DNA khuôn và là nơi bám của DNA polymerase, từ đó mạch tổng hợp được kéo dài. PCR là một quá trình lặp lại, mỗi chu kì gồm có 3 giai đoạn:
- Giai đoạn biến tính: DNA khuôn bị biến tính ở nhiệt độ 94 - 95ºC trong khoảng 1 phút để tách phân tử DNA thành hai sợi đơn. Mỗi sợi đơn sau đó sẽ trở thành một sợi khuôn cho mồi bám vào.
- Giai đoạn gắn mồi: Ở giai đoạn này, nhiệt độ của hỗn hợp được hạ xuống trong khoảng 30 - 60ºC để cho mồi kết hợp với sợi khuôn. Nhiệt độ và thời gian của bước này thay đổi, phụ thuộc vào trình tự của mồi.
- Giai đoạn kéo dài mạch: Sau khi mồi đã kết hợp được với sợi khuôn, nhiệt độ được tăng lên đến 72ºC cho phép quá trình tổng hợp các sợi mới xảy ra. Bước này cần 2 - 5 phút tùy thuộc chiều dài đoạn DNA cần khuếch đại.
Sản phẩm cuối cùng của chu kì trước sẽ trở thành nguyên liệu cho chu kỳ tiếp theo. Sau mỗi chu kì, số lượng DNA đích sẽ tăng lên gấp đôi. Sau một thời gian, lượng DNA được tăng lên theo cấp số nhân, nhờ đó người ta có đủ số lượng DNA phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
Nguyên liệu - DNA khuôn (Template).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - Cặp mồi H1255 - L16725 chuyên biệt. Ở đây, H (Heavy) và L (Light) là ký hiệu chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, còn chữ số là vị trí nuleotide đầu 3‟ của primer trong trình tự đầy đủ của mtDNA ở gà [15].
- Bộ hóa chất: dung dịch đệm có chứa NH4+, dNTPs 10mM, MgCl2 10mM, Taq DNA polymerase của hãng Fermentas.
- Nước khử ion vô trùng.
Thành phần của phản ứng khuếch đại gen cho một mẫu với tổng thể tích 25 l như trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng khuếch đại gen
Nước 10,85 l Buffer 2,5 l MgCl2 4 l dNTPs 2,5 l Mồi H1255-F 0,5 l Mồi L16725-R 0,5 l
Taq DNA polymerase 0,15 l
DNA temp 4 l
Tổng thể tích 25 l
Chu trình nhiệt
94ºC - 4 phút (94ºC - 1 phút; 50ºC- 1 phút; 72ºC- 1 phút 20 giây) x 30 chu kỳ; 72ºC -10 phút; giữ ở 4ºC.
Sau khi kết thúc phản ứng, điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%.
2.3.2.4. Kĩ thuật tách dòng gen
Kĩ thuật tách dòng gen bao gồm 4 bước sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Phản ứng nối ghép được thực hiện theo hướng dẫn sử dụng của bộ hóa chất Gene JETTM
PCR Cloning Kit. Vector tách dòng trong bộ Kit này là pJET1/Blunt chỉ ghép nối được với những đoạn DNA có đầu bằng hoặc đã dược làm bằng hóa. Ngoài ra hãng sản xuất đã cung cấp kèm theo enzyme AND blunting có tác dụng làm bằng hóa đầu của đoạn DNA cần ghép nối. Vì vậy, bộ Kit này phù hợp cho việc tách dòng không chỉ những đoạn gen đầu bằng mà cả những đoạn gen đầu dính (sản phẩm cắt enzyme giới hạn, sản phẩm PCR).
Hình 2.1. Sơ đồ vector tách dòng pJET1/blunt
Các sản phẩm PCR được nhân lên bằng enzyme taq polymerase trước khi tiến hành phản ứng ghép nối gen cần làm bằng hóa đầu 3‟ trong một hỗn hợp phản ứng gồm có 5µl 2X Reaction Buffer; 3µl sản phẩm PCR; 0,5µl H2O; 0,5µl enzyme làm bằng hóa DNA. Sau thời gian phản ứng, DNA blunting được biến tính ở nhiệt độ 70oC trong 5‟. Phản ứng ghép nối gen được tiến hành bằng cách bổ sung vào 0,5µl vector pJET1/Blunt Cloning vector (50ng/µl) và 0,5µl enzyme nối T4 ligase (5u/µl). Hỗn hợp này được để ở nhiệt độ phòng từ 5-30‟ sau đó dùng để biến nạp vào tế bào E. Coli.
Biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt
Bổ sung 2 l sản phẩm của phản ứng ghép nối vào mỗi ống tế bào khả biến đã được để trong đá khoảng 30 phút sau khi lấy ra từ -80oC, giữ trong đá
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 30 phút. Sốc nhiệt ở 42ºC trong 90 giây sau đó chuyển ngay vào đá và giữ trong 5 phút. Bổ sung 300 l SOC, nuôi lắc 200 v/p ở 37ºC trong 1 giờ. Cấy trải các tế bào này trên môi trường LB đặc có bổ sung thêm các thành phần như sau: Amp (50 l/ml) và nuôi ở 37ºC qua đêm.
*Thành phần các môi trường nuôi cấy vi sinh vật:
- LB lỏng (môi trường Luria- Bertani): Bacto-Trypton 10g/l; cao nấm men 5g/l; NaCl 10g/l; NaOH 2mM.
- LB đặc: gồm môi trường LB lỏng có bổ sung Agar - Agar 15g/l.
- Môi trường SOC: Trypton 5 %; cao nấm men 0,5 %; NaCl 10mM; KCl 2,5mM; MgCl2 10mM; MgSO4 10mM; Glucose 20mM.
Tách DNA plasmid
Các khuẩn lạc trắng sau khi biến nạp được cấy chuyển, nuôi lắc với tốc độ 200 v/p trong 2ml môi trường LB lỏng có bổ sung Amp (50 g/ml) ở 37ºC, 15 giờ. Sau đó, lắc đều hỗn hợp nuôi cấy và đổ dịch vào trong ống eppendoft loại 1,5 ml rồi tiến hành thu plasmid theo quy trình kỹ thuật sau:
Ly tâm ở 6000 v/p, 6 phút, 4ºC. Bỏ dịch, thấm khô. Bổ sung 150 l sol I, vortex cho tan tủa.
Thêm 150 l sol II, đảo nhẹ, và giữ trong đá.
Thêm 150 l sol III, đảo nhẹ, giữ trong đá hoặc để trong tủ lạnh 0ºC trong 5'. Ly tâm 12000 vòng, 15 phút, 4ºC. Hút dịch sang ống eppendoft mới.
Thêm 1 ml cồn 100%, đảo nhẹ và để lạnh ở -20ºC trong ít nhất là 3 giờ. Ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4ºC. Thu cặn, rửa tủa bằng EtOH 70%, ly tâm 12000 v/p trong 5 phút, 4ºC. Làm khô mẫu trong máy hút chân không. Cho 30 l RNAse 10 g/ ml, búng đều và ủ mẫu ở bể ổn nhiệt ở 37ºC trong 1 giờ. Điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
*Thành phần của các dung dịch tách chiết plasmid:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - Dung dịch II (Sol II): SDS 10 %, NaOH 0,2M. Pha mới trước khi sử dụng và bảo quản ở nhiệt độ phòng.
- Dung dịch III (Sol III): CH3COOK, CH3COOH (giữ ở tủ 4ºC). Kiểm tra DNA plasmid bằng enzym giới hạn
Mục đích của bước này là kiểm tra xem đoạn DNA đích có được chèn vào vector hay không.
Thành phần của phản ứng cắt bao gồm: Buffer Tango 1 l; enzyme
XbaI 0,2 l (10u/ l); DNA plasmid 3 l; H2O 5,6 l (tổng thể tích 10 l). Hỗn hợp này sau đó đem ủ ở 37ºC trong ít nhất 3 giờ. Sau đó sản phẩm được điện di trên gel agarose 0,8%.
2.3.2.5. Phương pháp xác định trình tự DNA
Nguyên tắc chung
Trình tự vùng D-loop được xác định dựa trên nguyên tắc chung của phương pháp Sanger [3]: tạo ra các đoạn oliogonuleotide hơn kém nhau 1 nuleotide, kết thúc bởi các ddNTP đã được đánh dấu huỳnh quang. Để tạo ra các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành PCR