Để nhân đƣợc đoạn gen mã hóa cho enzyme Invertase bằng kỹ thuật RT-PCR điều quan trọng nhất là phải có đƣợc cặp mồi đặc hiệu cho trình tự của đoạn gen mã hóa cho enzyme Invertase. Chúng tôi đã sử dụng từ khóa
“Invertase Sugarcane” để tìm kiếm trong ngân hàng dữ liệu gen NCBI các trình tự gen Invertase đã đƣợc công bố (www.ncbi.nlm.nih.gov). Kết quả đã thu đƣợc sáu trình tự của gen mã hóa cho enzyme Invertase ở cây mía, trong
đó có 5 trình tự mã hóa cho enzyme Invertase hòa tan (soluble acid Invertase)
với mã số AF062734, AF 062735, AF083855, AF083856, AY302083; và một
trình tự mã hóa cho enzyme Invertase liên kết màng (cell wall Invertase) có
mã số AY302084 (Bảng 3.2). Sử dụng chƣơng trình MegAlign (DNAstar) so sánh độ tƣơng đồng của các trình tự trên với nhau cho thấy năm trình tự của Invertase hoà tan tƣơng đồng cao mặc dù đƣợc phân lập từ các giống mía khác nhau và có độ tƣơng đồng 46% với đoạn trình tự mã hoá cho Invertase liên kết màng. Trình tự đầy đủ của gen này với mã số AY302083 có độ dài 1923 bp. Trong nghiên cứu của chúng tôi đoạn gen dài 435 nucleotide (từ nucleotide vị trí 384 tới vị trí 818 bp - vùng có trình tự bảo thủ cao nhất) nằm trên gen mã hoá enzyme Invertase hòa tan (AY302083) đƣợc lựa chọn để tách dòng. Sau đó với mục đích giúp sản phẩm PCR gắn đƣợc vào vector tách dòng
pENTR/D chúng tôi đã gắn thêm đồng thời vào mồi đầu 3’ một đoạn trình tự
CACC để tạo vị trí bám cho enzyme TOPO-Isomerasse (GTGG) gắn trên vector nhân dòng PENTR/D-TOPO. Cặp mồi đƣợc đặt tổng hợp bởi hãng BIONEER, Hàn Quốc. Trình tự cặp mồi đặc hiệu thu đƣợc ở bảng 3.1 nhƣ sau:
Bảng 3.1. Trình tự và các thông số cần thiết của cặp mồi 3’INV và 5’INV
Mồi Trình tự mồi Tm(oC) %GC
(5’INV) 5’-CATCTGGGGCAACAAGATC-3’ 52,3 52,6
(3’INV) 5’-CACCAAGTGCACGAAGTCCTTG-3’ 59,1 54,5
Bảng 3.2. Mã số các trình tự đoạn gen Invertase ở mía trên ngân hàng gen NCBI
STT Mã số Chiều dài Dạng Tên Tác giả
1 AY302083 2274 bp mRNA Invertase hòa
tan
Peters,K.F., Grof,C.P.L. and Botella,J.R.
2 AF062734 1808 bp mRNA Invertase hòa
tan
Albert,H.H., Zhu,Y.J. and Moore,P.H.
3 AF083856 1402 bp mRNA Invertase hòa
tan
Albert,H.H., Zhu,Y.J. and Moore,P.H.
4 AF083855 494 bp mRNA Invertase hòa
tan
Albert,H.H., Zhu,Y.J. and Moore,P.H.
5 AF062735 1808 bp mRNA Invertase hòa
tan
Albert,H.H., Zhu,Y.J. and Moore,P.H.
6 AY302084 1889 bp mRNA Invertase liên kết màng
Peters,K.F., Grof,C.P.L., (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Albertson,P.L. and Botella,J.R.