3.7.1. Quy trình tái sinh mía thông qua mô sẹo
Từ các nghiên cứu tái sinh và chuyển gen thành công ở cây mía cho thấy rằng tỉ lệ tái sinh thu đƣợc cao và hiệu quả thông qua nguyên liệu ban đầu là mô sẹo. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành thử nghiệm tạo mô
sẹo với giống mía ROC10 in vitro trên môi trƣờng MS đối chứng không có
2,4D và các môi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo M1-M4 (Bảng 2.4). Kết quả thu đƣợc cho thấy ở môi trƣờng đối chứng MS (không có 2,4D) hoàn toàn không
tạo đƣợc mô sẹo. Còn các mẫu trên môi trƣờng cảm ứng có bổ sung hàm lƣợng chất kích thích sinh trƣởng 2,4D đều tạo đƣợc mô sẹo và cho hiệu quả tái sinh mía đƣợc thể hiện thông qua bảng sau:
Bảng 3.3. Khả năng tạo mô sẹo và tái sinh ở giống mía ROC10 in vitro
trên các môi trƣờng thử nghiệm M1 - M4.
Môi trƣờng 2,4-D (mg/l) Tổng mẫu cấy Tỉ lệ tạo mô sẹo (%) Tỉ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi / 1 khối mô sẹo
M1 3 3x130 83,07 ± 0,44 67,95 ± 1,36 42,66 ± 1,45
M2 4 3x130 86,15 ± 3,11 46,41 ± 3,33 20,66 ± 2,96
M3 5 3x130 71,79 ± 0,68 63,08 ± 1,33 32,33 ± 1,45
M4 6 3x130 83,33 ± 2,89 37,95 ± 1,12 17,66 ± 4,33
Bảng 3.3 cho thấy, các mẫu ở môi trƣờng M1 có bổ sung 3 mg/l 2,4D cho tỉ lệ tạo mô sẹo và hiệu suất tái sinh cao hơn hẳn so với các môi trƣờng M2 - M4 có bổ sung 4, 5, 6 mg/l 2,4D; trong đó tỉ lệ tạo chồi đạt 67,95% và số chồi trên một khối mô sẹo đạt khoảng 42,66. Nhƣ vậy, môi trƣờng M1 có
bổ sung 3 mg/l 2,4D cho kết quả tạo mô sẹo và tái sinh cây ở mía ROC10 in
vitro tốt nhất trong thí nghiệm này. Do đó, chúng tôi chọn môi trƣờng M1 có bổ sung 3 mg/l 2,4D làm môi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo cho việc tái sinh và chuyển gen ở mía trong các thí nghiệm tiếp theo. Quá trình tái sinh cây từ mô sẹo đến cây hoàn chỉnh đƣợc minh họa trong hình 3.8.
Mặt khác, chúng tôi tiếp tục nhân nuôi mô sẹo trong môi trƣờng lỏng
lắc M1 có bổ sung 3 mg/l 2,4D trong vòng 1 tuần, ở 27oC, lắc 90 vòng/phút,
Cây mía ROC10 in vitro Đoạn thân sát gốc dài 0,5 cm trên môi trƣờng cảm
ứng tạo mô sẹo
Mô sẹo
Tạo cây hoàn chỉnh Mô sẹo lên mầm xanh Mô sẹo đang nhú mầm
Hình 3.8. Quy trình tái sinh mía ROC10in vitro từ mô sẹo 3.7.3. Chọn lọc mô sẹo và tái sinh cây chuyển gen
Quy trình chuyển gen có hiệu quả là yếu tố rất quan trọng trong việc chuyển gen vào thực vật. Sau khi thử nghiệm đƣợc môi trƣờng tái sinh cây mía thông qua mô sẹo, chúng tôi tiến hành thử nghiệm việc chuyển gen vào
cây mía thông qua việc sử dụng gen chỉ thị gus-intron. Trong nghiên cứu này,
chúng tôi thử nghiệm hai chủng vi khuẩn A.tumefaciens khác nhau là
EHA1300 và CV58C1 cùng mang vector chuyển gen pPTN289, ngƣỡng thời gian nhiễm khuẩn là 10 và 30 phút.
Chúng tôi đã thử nghiệm lây nhiễm khuẩn với mô sẹo theo phƣơng pháp thổi khô sau nhân nuôi trong môi trƣờng lỏng lắc M1. Song chúng tôi đã không thu đƣợc kết quả chuyển gen mong muốn khi kiểm tra biểu hiện gen
chỉ thị gus-intron với dung dịch X-gluc. Do đó, chúng tôi tiến hành hƣớng
nghiên cứu thứ hai là chuyển mô sẹo sau nhân nuôi sang môi trƣờng cảm ứng tạo chồi Mc sau đó mới tiến hành lây nhiễm khuẩn. Ở thời gian biến nạp 10
phút các mô sẹo ở cả hai chủng vi khuẩn đều không thu đƣợc mẫu có biểu
hiện gen gus. Trong khi đó ở thời gian nhiễm khuẩn 30 phút, mẫu có biểu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
hiện gen gus xuất hiện ở cả hai công thức với hai chủng khuẩn nghiên cứu. Tỉ
lệ biểu hiện gen gus trên mô sẹo đạt 31,67% với chủng CV58C1 và 11,67%
khi sử dụng chủng EHA1300. Khi sử dụng hai chủng vi khuẩn này với ngƣỡng thời gian nhiễm khuẩn là 30 phút, chúng tôi đều thu đƣợc các chồi mía sống sót trên môi trƣờng chọn lọc (với CV58C1 là 18,57% và EHA1300 là 7,14%).
Bảng 3.4. Kết quả biến nạp gen gus-intron vào cây mía
Chủng vi khuẩn A.tumefaciens Thời gian biến nạp (phút) Tỉ lệ biểu
hiện gen gus
(%) Tỉ lệ mẫu tái sinh (%) Tỉ lệ mẫu sống sót trên môi trƣờng có bổ sung 2 mg/l ppt (%) CV58C1 30 31,67 ± 0,65 81,43 ± 1,56 18,57 ± 1,28 EHA1300 30 11,67 ± 0,89 92,85 ± 0,31 7,14 ± 0,69
Nhƣ vậy, bƣớc đầu chúng tôi đã thu đƣợc kết quả khi tiến hành chuyển
gen gus vào cây mía thông qua mô sẹo theo phƣơng pháp cảm ứng tạo chồi.
Tuy nhiên do thời gian có hạn, các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả chuyển gen vẫn chƣa hoàn toàn đƣợc tối ƣu. Mặc dù vậy, việc thu đƣợc các mô sẹo tái
sinh có biểu hiện của gen chỉ thị gus đã cho thấy việc sử dụng công nghệ
RNAi để tạo cây mía chuyển gen làm tăng khả năng tích trữ đƣờng trong cây mía là một hƣớng đi triển vọng trong tƣơng lai.
Hình 3.9. Biến nạp gen gus-intron vào cây mía ROC10 in vitro
thông qua trung gian A.tumefaciens
Mô sẹo biến nạp trên môi
trƣờng đồng nuôi cấy Mc nhuộm với dung dịch X-gluc Mô sẹo biểu hiện gus khi
Mô sẹo tạo chồi trên Mc có bổ sung 500 mg/l cefotaxime Chồi cây trên môi trƣờng chọn lọc
Mr có bổ sung 500 mg/l cefotaxime và 2 mg/l ppt
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
KẾT LUẬN:
1. Phân lập đƣợc đoạn gen mã hoá Invertase có kích thƣớc khoảng 435 bp
từ giống mía ROC1 in vitro xúc tác quá trình phân huỷ sucrose.
2. Thiết kế đƣợc vector chuyển gen INV-RNAi ức chế sự biểu hiện của
Invertase và biến nạp thành công chủng vi khuẩn A.tumefaciens
CV58C1.
3. Chọn lọc một số môi trƣờng thích hợp tái sinh cây mía thông qua mô
sẹo (môi trƣờng tạo mô sẹo M1, môi trƣờng tạo chồi Mc, môi trƣờng
tạo rễ Mr) và bƣớc đầu chuyển gen chỉ thị gus-intron vào cây mía.
ĐỀ NGHỊ:
Tiến hành chuyển vector ức chế biểu hiện mã hóa Invertase (INV- RNAi) ở cây mía nhằm tăng trữ lƣợng đƣờng của các giống mía ở Việt Nam. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
BÀI BÁO CỦA TÁC GIẢ
CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN ĐÃ ĐƢỢC CÔNG BỐ
Lƣu Thị Cƣ,Đỗ Tiến Phát, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình, Lê Quỳnh
Liên (2009) Phân lập và thiết kế vector ức chế biểu hiện gen mã hoá
Invertase (-fructofuranosidase) ở cây mía. Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc_Thái Nguyên, tháng 11 năm 2009.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Quyết định số 26/2007/QĐ-TTg, về việc phê duyệt “Quy hoạch phát triển
mía đường đến năm 2010 và định hướng đến năm 2020”.
2. Hoàng Thị Sản (2003) Phân loại học thực vật. Nxb Giáo dục
3. Trần Văn Sỏi (2003) Cây mía. Nhà xuất bản Nghệ An.
4. Đỗ Năng Vịnh (2007) Công nghệ can thiệp RNA (RNAi) gây bất hoạt gen
và tiềm năng ứng dụng to lớn. Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(3): 265-275.
5. Vũ Văn Vụ (1999) Sinh lí thực vật ứng dụng. Nxb Giáo dục.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
6. Avigad G and Dey PM (1997) Carbohydrate metabolism: storage
carbohydrates. Plant biochemistry Acedemic Press Ltd, pp: 143-204.
7. Balibrea ME, Rus-Alvarez AM, Bolarin MC, Perez-Alfocea F (1997) Fast
changes in soluble carbohydrates and proline content in tomato seedlings in response to ionic and nonionic iso-osmostic stress, J. Plant physiol. (151): 222-226.
8. Baulcomble D (2004) RNA silencing in plants. Nature 431 (7006): 356-63.
9. Chen S, Hajirezaei M, Bornke F (2008) Differential expression of sucrose
phosphate synthase isoenzymes in tobaco reflects their functional specialization during dark governed starch mobilization in source leaves.
Plant Cell Environ. 31(1): 165-76 elegans. Nature. 391: 806-811.
10. Geigenberger P, Reimholz R, Deiting U, Sonnewald U and Stitt M (1999)
Decreased expression of sucrose phosphate Synthase Strongly inhibits the water stress-induced synthesis of sucrose in growing potato tubers. The plant Journal. 19: 119-129.
11. Groenewald J, Botha FC (2007) Down-regulation of pyrophosphate: fructose 6-phosphate 1-phosphotransferase (PFP) activity in Sugarcane enhances sucrose accumulation in immature internoods. Transgenic Res.
12. Guy CL (1990) Cold acclimation and freezing stress tolerance: role of
protein metabolism. Annu. Rev. Plant physiol. Plant Mol. Biol. 41: 187- 223.
13. Haigler CH, Singh B, Zhang D, Hwang S, Wu C, Cai WX, Hozain M, Kang W, Kiedaisch B, Strauss RE, Hequet EF, Wyatt BG, Jwiden GM, Holaday
AS (2007) Transgenic cotton over-producing spinach sucrose phosphate (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
synthase showed enhanced leaf sucrose synthesis and improved fiber quality under controlled environmental conditions. Plant Mol Biol. 63 (6): 815-32.
14. Hesse H, Sonnewald U, Willmitzer L (1995) Cloning and expression
analysis of sucrose phosphate synthase from sugar beet (Beta vulgaris L.).
Mol Gen Genet. 247 (4): 515-20.
15. Huber SC. and Huber JL. (1992) Role of sucrose-phosphate Synthase in
Sucrose Metabolism in leaves. Plant physiol. 99: 1275-1278.
16. Huber SC, and Huber JL(1996) Role and regulation of Sucrose phosphate
synthase in higher plants. Annu. Rew. Plant physiol. Plant Mol.Biol. 47: 431-444.
17. Ingram J, Chadler JW, Gallagher L, Salamini F, Bartels D (1997) Analysis
of cDNA clones encoding sucrose-phosphate synthase in relation to sugar interconversions associated with dehydration in the resurrection plant,
Craterostigma plantagineum Hochst. Plant Physiol. 115:113-121.
18. Klann EM, Hall B, Bennett AB (1996) Antisense acid invertase (TIV1) gene
alters soluble sugar composition and size in transgenic tomato fruit. Plant Physiol. 112 (3): 1321-30.
19. Le QL, Mahler V, Lorenz Y, Scheurer S, Biemelt S, Vieths S, Sonnewald U
(2006b) Reduced allergenicity of tomato fruits harvested from Lyc e 1
silenced transgenic tomato plants. J. Aller. Clin. Immunol. 118(5):1176-83.
20. Liu Q, Singh SP, Green AG (2002) High-stearic and High-oleic cottonseed
oils produced by hairpin RNA-mediated post-transcriptional gene silencing. Plant Physiol. 129(4): 1732-43.
21. Lunn JE, Gillespie VJ, Furbank RT (2003) Expression of a cyanobacterial
sucrose-phosphate synthase from Synechocystis sp. PCC 6803 in transgenic plants. J Exp Bot. 54 (381): 223-37
22. Manickavasagam M, Ganapathi A, Anbazhagan VR, Sudhakar B, Selvaraj N,
Vasudevan A, Kasthurirengan S (2004) Agrobacterium-mediated genetic
transformation and development of herbicide-resistant sugarcane (Saccharum species bybrids) using axillary buds. Plant Cell Rep 23: 134-143.
23. Morgan JM (1984) Osmoregulation and water stress in higher plant, Ann
Rev. Plant physiol. 35: 299-319
24. Nguyen-Quoc B, Foyer CH (2001) A role for ‘futile cycles’ involving
invertase and sucrose synthase in sucrose metabolism of tomato fruit. J Exp Bot. 52 (358): 881-9.
25. Ogita S, Uefuji H, Yamaguchi Y, Koizumi N, Sano H (2003) Producing
decaffeinated coffee plants. Nature 423(6942): 823.
26. Quick P, Siegl G, Neuhaus E, Feil R, Stitt M (1989) Sort term water stress (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
leads to stimulation of sucrose synthesis by activating sucrose-phosphate synthase. Planta. 177: 535–546.
27. Salerno GL, Pagnussat GC, Pontis HG (1998) Studies on sucrose phosphate
synthase from rice leaves. Cell Mol Biol 44(3): 407-16
28. Santosa DA, Hendroko R, Farouk A và Greiner R (2004) A rapid and
highly efficient method for transformation of sugarcane callus. Molecular
29. Snyman SJ, Meyer GM., Richards JM, Haricharan N, Ramgareeb S,
Huckett BI (2006) Refining the application of direct embryogenesis in
sugarcane: effect of the developmental phase of leaf disc explants and the timing of DNA transfer on transformation efficiency. Plant Cell Rep. 25: 1016–1023.
30. Stitt M (1989) Product inhibition of potato tuber pyrophosphate, Fructose
6-phosphate phosphotransferase by phosphate and pyrophosphate. Plant physiol. 89: 628-633.
31. Sugihartor B, Sakakibara H, Sumadi and Sugiyama T (1997) Differential
Expression of Two Genes for Sucrose-phosphate-Synthase in Sugarcane: Molecular Cloning of the cDNAs and Comparative Analysis of Gene Expression. Plant cell physiol. 38: 961-965.
32. Wesley SV, Helliwell CA, Smith NA, Wang MB, Rouse DT, Liu Q,
Gooding PS, Singh SP, Abbott D, Stoutjesdijk PA, Robinson SP, Gleave
AP, Green AG, Waterhouse PM (2001) Construct design for efficient,
eddective and high-throughput gene silencing in plants. Plant J. 27(6): 581-90.
33. Worrell AC, Bruneau JM, Summerfelt K, Boersig M, Voelker TA (1991)
Expression of a maize sucrose phosphate synthase in tomato alters leaf carbohydrate partitioning. Plant Cell. 3(10): 1121-30.
34. Zhangsun D, Luo S, Chen R, Tang K (2007) Improved Agrobacterium-
mediated genetic transformation of GNA transgenic sugarcane. Section Cellular and Molecular Biology 62 (4): 386-393.
35. Zhu YJ, Komor E, and Moore PH. (1997) Sucrose Accumulation in the
Sugarcane Stem 1s Regulated by the Difference between the Activities of Soluble Acid Invertase and Sucrose Phosphate Synthase. Plant Physiol. 115(2): 609-616.
PHỤ LỤC
Môi trƣờng MS cơ bản:
- MS I: KNO3:1900 mg/l; NH4NO3:1650 mg/l; MgSO4.7H2O:370 mg/l; KH2PO4:170 mg/l
- MS II: CaCl2.2H2O mg/l
- MS III: H3BO3:6,2 mg/l; MnSO4: 22,3 mg/l; ZnSO4: 8,6 mg/l; KI: 0,83 mg/l; Na2MoO4: 0,25 mg/l; CuSO4: 0,025 mg/l; CoCl2: 0,025 mg/l
- MS IV:Na2EDTA: 37,3 mg/l; FeSO4.7H2O: 27,8 mg/l
- MS V: Glycin: 2 mg/l; Nicotinic: 0,5 mg/l; B1: 0,5 mg/l; B6: 0,5 mg/l
Môi trƣờng LB: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- LB lỏng: Môi trƣờng LB lỏng: 0,5% (5 g/l) dịch chiết nấm men (Yeast extract), 1% (10 g/l) bacto-Tryptone, 1% (10 g/l) NaCl. Hoặc dùng 25g LB bột LB pha sẵn cho 1l LB lỏng.
- LB đặc: LB lỏng bổ sung 1,5% (15g/l) Bactor-aga.
Dung dịch đệm tách plasmid:
- Sol I: 50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM ETDA pH8 - Sol II: 0.2 NaOH, SDS 1%
- Sol III: 60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml CH3COOH; 28,5 ml H20
Các môi trƣờng đƣợc khử ở áp suất 4 atmotphe và 117o
C trong 15 phút.
Đệm điện di gel agarose:
- TAE 50 X (100 ml) : Tris -base 24.2 g, axit axetic 5.71g , EDTA 0.1M
pH8 50ml thêm nƣớc đến 100 ml.
- Đệm tra mẫu (loading buffer): 0,1 ml bromophenol blue 10%; 0,3 ml