Kỹ thuật Gateway Cloning là một kỹ thuật nhân dòng phổ biến và hiệu quả cho việc gắn trình tự DNA vào hệ thống một hoặc nhiều vector. Trong thí 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AY302083 AGGAACTGGATGAACGACCCCAATGGCCCGGTGTACTACAAGGGCTGGTACCACCTGTTCTACCAATACAACCCGGACGGCGCCATCTGGGGCAACAAGA amplified ---CATCTGGGGCAACAAGA 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AY302083 TCGCGTGGGGCCACGCCGTCTCCCGCGACCTCATCCACTGGCGCCACCTCCCGCTGGCCATGCTGCCCGACCAGTGGTACGACACCAACGGCGTCTGGAC amplified TCGCGTGGGGCCACGCCGTCTCCCGCGACCTCATCCACTGGCGCCACCTCCCGCTGGCCATGGTGCCCGACCAGTGGTACGACACCAACGGCGTGTGGAC 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AY302083 GGGCTCCGCCACCACGCTCCCCGACGGCCGCCTCGCCATGCTCTACACCGGCTCCACCAACGCCTCCGTGCAGGTGCAGTGCCTCGCCGTGCCCGCCGAC amplified GGGCTCCGCCACCACGCTCCCCGACGGCCGCCTCGCCATGCTCTACACGGGCTCCACCAACGCCTCCGTGCAGGTGCAGTGCCTCGCCGTGCCCGCCGAC 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AY302083 GACGCCGACCCGCTGCTCACCAACTGGACCAAGTACGAGGGCAACCCGGTGCTGTACCCGCCGCCGGGCATCGGGCCCAAGGACTTCCGCGACCCCACCA amplified GACGCCGACCCGCTGCTCACCAACTGGACCAAGTACGAGGGCAACCCGGTGCTGTACCCGCCGCCGGGGATCGGGCCCAAGGACTTCCGCGACCCCACCA 710 720 730 740 750 760 770 780 790 800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AY302083 CGGCGTGGTTCGACCCGTCGGACAACACCTGGCGCATCGTCATCGGCTCCAAGGACGACGCCGAGGGCGACCACGCCGGCATCGCCGTGGTGTACCGCAC amplified CGGCGTGGTTCGACCA---
nghiệm này chúng tôi thực hiện phản ứng LR với các thành phần đã trình bày ở mục 2.2.2.1. để gắn vector INV_pENTR với vector pK7GWIWG2(II) nhằm
thu đƣợc vector chuyển gen INV_RNAi của gen mã hóa Invertase. Phản ứng
này đƣợc tiến hành với sự xúc tác của enzyme LR-clonase và Proteinase K ở nhiệt độ phòng.
pK7GWIWG2(II) là một vector chuyển gen đƣợc cấu trúc bởi hai vùng
gắn đặc biệt là: attR1-ccdB-attR2 có chiều ngƣợc nhau và đƣợc nối với nhau
nhờ một đoạn intron. Do đó, khi thực hiện phản ứng lai LR thì sẽ tạo ra sản phẩm là một plasmid INV_RNAi có hai vị trí gắn mang đoạn gen Invertase có chiều ngƣợc nhau: sense-intron-antisense (Invertase-intron-antiInvertase). Đoạn intron của vector pK7 có vai trò rất quan trọng trong việc tạo đoạn thắt nút (vòng) để RNA sợi đôi dễ đƣợc hình thành (Invertase-intron- antiInvertase) và hoạt động một cách ổn định trong genome của vật chủ khi nó đƣợc chuyển vào. Đây chính là cấu trúc RNAi cần thiết kế để chuyển gen vào cây mía nhằm tăng trữ lƣợng đƣờng của mía cao hơn một cách ổn định.
Hình 3.5. Mô hình cấu trúc chuyển gen INV_RNAi 3.5.2. Biến nạp vector INV_RNAi vào tế bào khả biến E.coli
Vector tái tổ hợp INV_RNAi đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli
TOP 10 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt ở 42oC với khoảng thời gian là 1 phút 30
giây. Sau đó, khuẩn sẽ đƣợc nuôi phục hồi với 250 μl LB lỏng ở 37oC ở tủ lắc
có kháng sinh 100 mg/l spectinomycin, 40 mg/l streptomycin và 50 mg/l chloramphenicol. Kết quả thu đƣợc một lƣợng lớn các khuẩn lạc màu trắng mọc trên môi trƣờng chọn lọc.
Vector pK7GWIWG2(II) là vector có cấu trúc mang gen kháng các
kháng sinh spectinomycin, streptomycin, chloramphenicol và gen ccdB mã
hóa cho plasmid F gây ức chế sinh trƣởng của tế bào E.coli, còn vector
INV_RNAi không có gen ccdB do gen Invertase chèn vào thay thế. Vì vậy,
các khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trƣờng chọn lọc chỉ có thể là những khuẩn lạc
có mang plasmid pK7GWIWG2(II) nhƣng vị trí chứa đoạn gen ccdB đã bị đột
biến và các khuẩn lạc có mang plasmid INV_RNAi. Chọn ngẫu nhiên 3 khuẩn lạc đƣợc đánh số từ 1 đến 3 nuôi trong môi trƣờng lỏng có các kháng sinh chọn lọc tƣơng tự và tiến hành tách plasmid từ các dòng khuẩn đó. Để kiểm tra các plasmid thu đƣợc có chính xác là INV_RNAi hay là pK7GWIWG2(II)
nhƣng vị trí chứa đoạn gen ccdB đã bị đột biến. Chúng tôi thực hiện phản ứng
cắt enzyme giới hạn đặc hiệu XbaI và HindIII đối với 3 plasmid từ khuẩn lạc
số 1, 2 và 3. Theo tính toán trên lý thuyết thì sản phẩm của phản ứng cắt enzyme sẽ cho 3 đoạn có kích thƣớc là: Đoạn 1 dài 978 bp mang đoạn
Invertasechiều xuôi, đoạn 2 dài 2825 bp mang đoạn Invertase chiều ngƣợc và
cuối cùng là phần còn lại của vector nhận pK7GWIWG(II) dài 8114 bp. Hình 3.6 cho thấy sản phẩm của phản ứng cắt enzyme thu đƣợc các phân đoạn có các kích thƣớc tƣơng ứng với dự tính ở cả 3 plasmid 1, 2 và 3 và có sự khác biệt rõ rệt so với đối chứng là vector không biến nạp pK7GWIWG(II), chứng tỏ cấu trúc INV_RNAi đã đƣợc thiết kế.
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid INV_RNAi tổ hợp với
HindIII và XbaI
(M): Marker 1kb; (1), (2), (3): các dòng plasmid tái tổ hợp; (-): đối chứng vector pK7GWIWG(II)
3.6. BIẾN NẠP VECTOR CHUYỂN GEN INV_RNAi VÀO CHỦNG VI
KHUẨN A.TUMEFACIENS CV58C1.
Để kiểm tra hoạt động của cấu trúc INV_RNAi trên vector tái tổ hợp trong cây trồng cũng nhƣ tạo nguyên liệu cho quá trình chuyển gen ức chế biểu hiện gen mã hóa Invertase ở cây mía, thì cấu trúc INV_RNAi phải đƣợc
biến nạp vào vi khuẩn A.tumefaciens CV58C1 bằng phƣơng pháp xung điện.
Đây là một phƣơng pháp biến nạp có hiệu quả cao trong thời gian ngắn.
Plasmid tái tổ hợp INV_RNAi số 2 đƣợc biến nạp vào A.tumefaciens bằng
xung điện với thành phần và các bƣớc tiến hành biến nạp đƣợc trình bày ở mục 2.2.2.3. Kết quả cho thấy trên đĩa môi trƣờng có bổ sung kháng sinh chọn lọc 100 mg/l streptomycin, 100 mg/l spectinomycin và 50 mg/l rifamycin thu đƣợc những khuẩn lạc màu trắng. Sau đó chọn ngẫu nhiên 2 dòng khuẩn lạc nhân nuôi trong môi trƣờng lỏng có bổ sung các kháng sinh
chọn lọc 100 mg/l streptomycin, 100 mg/l spectinomycin và 50 mg/l
Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR plasmid INV-RNAi trong
A.tumefaciens với cặp mồi đặc hiệu 5’INV và 3’INV
(M):Marker 1kb; (1), (2): các dòng plasmid tái tổ hợp; (-): đối chứng âm
Tách plasmid theo Sambroock và kiểm tra sự có mặt của INV_RNAi
trong A.tumefaciens CV58C1 bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu
5’INV và 3’INV. Kết quả kiểm tra hình 3.7 cho thấy các dòng khuẩn lạc đều cho kết quả dƣơng tính kích thƣớc khoảng 450 bp mong muốn. Nhƣ vậy, chứng tỏ chúng tôi đã tạo đƣợc vector chuyển gen INV_RNAi trong chủng vi
khuẩn A.tumefaciens CV58C1. Đây là nguồn nguyên liệu phục vụ cho thí
nghiệm chuyển gen tiếp theo nhằm tạo dòng mía bất hoạt gen mã hoá Invertase, tăng lƣợng sucrose tích trữ.
3.7. TÁI SINH VÀ BƢỚC ĐẦU BIỂU HIỆN GEN GUS Ở MÍA 3.7.1. Quy trình tái sinh mía thông qua mô sẹo 3.7.1. Quy trình tái sinh mía thông qua mô sẹo
Từ các nghiên cứu tái sinh và chuyển gen thành công ở cây mía cho thấy rằng tỉ lệ tái sinh thu đƣợc cao và hiệu quả thông qua nguyên liệu ban đầu là mô sẹo. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành thử nghiệm tạo mô
sẹo với giống mía ROC10 in vitro trên môi trƣờng MS đối chứng không có
2,4D và các môi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo M1-M4 (Bảng 2.4). Kết quả thu đƣợc cho thấy ở môi trƣờng đối chứng MS (không có 2,4D) hoàn toàn không
tạo đƣợc mô sẹo. Còn các mẫu trên môi trƣờng cảm ứng có bổ sung hàm lƣợng chất kích thích sinh trƣởng 2,4D đều tạo đƣợc mô sẹo và cho hiệu quả tái sinh mía đƣợc thể hiện thông qua bảng sau:
Bảng 3.3. Khả năng tạo mô sẹo và tái sinh ở giống mía ROC10 in vitro
trên các môi trƣờng thử nghiệm M1 - M4.
Môi trƣờng 2,4-D (mg/l) Tổng mẫu cấy Tỉ lệ tạo mô sẹo (%) Tỉ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi / 1 khối mô sẹo
M1 3 3x130 83,07 ± 0,44 67,95 ± 1,36 42,66 ± 1,45
M2 4 3x130 86,15 ± 3,11 46,41 ± 3,33 20,66 ± 2,96
M3 5 3x130 71,79 ± 0,68 63,08 ± 1,33 32,33 ± 1,45
M4 6 3x130 83,33 ± 2,89 37,95 ± 1,12 17,66 ± 4,33
Bảng 3.3 cho thấy, các mẫu ở môi trƣờng M1 có bổ sung 3 mg/l 2,4D cho tỉ lệ tạo mô sẹo và hiệu suất tái sinh cao hơn hẳn so với các môi trƣờng M2 - M4 có bổ sung 4, 5, 6 mg/l 2,4D; trong đó tỉ lệ tạo chồi đạt 67,95% và số chồi trên một khối mô sẹo đạt khoảng 42,66. Nhƣ vậy, môi trƣờng M1 có
bổ sung 3 mg/l 2,4D cho kết quả tạo mô sẹo và tái sinh cây ở mía ROC10 in
vitro tốt nhất trong thí nghiệm này. Do đó, chúng tôi chọn môi trƣờng M1 có bổ sung 3 mg/l 2,4D làm môi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo cho việc tái sinh và chuyển gen ở mía trong các thí nghiệm tiếp theo. Quá trình tái sinh cây từ mô sẹo đến cây hoàn chỉnh đƣợc minh họa trong hình 3.8.
Mặt khác, chúng tôi tiếp tục nhân nuôi mô sẹo trong môi trƣờng lỏng
lắc M1 có bổ sung 3 mg/l 2,4D trong vòng 1 tuần, ở 27oC, lắc 90 vòng/phút,
Cây mía ROC10 in vitro Đoạn thân sát gốc dài 0,5 cm trên môi trƣờng cảm
ứng tạo mô sẹo
Mô sẹo
Tạo cây hoàn chỉnh Mô sẹo lên mầm xanh Mô sẹo đang nhú mầm
Hình 3.8. Quy trình tái sinh mía ROC10in vitro từ mô sẹo 3.7.3. Chọn lọc mô sẹo và tái sinh cây chuyển gen
Quy trình chuyển gen có hiệu quả là yếu tố rất quan trọng trong việc chuyển gen vào thực vật. Sau khi thử nghiệm đƣợc môi trƣờng tái sinh cây mía thông qua mô sẹo, chúng tôi tiến hành thử nghiệm việc chuyển gen vào
cây mía thông qua việc sử dụng gen chỉ thị gus-intron. Trong nghiên cứu này,
chúng tôi thử nghiệm hai chủng vi khuẩn A.tumefaciens khác nhau là
EHA1300 và CV58C1 cùng mang vector chuyển gen pPTN289, ngƣỡng thời gian nhiễm khuẩn là 10 và 30 phút.
Chúng tôi đã thử nghiệm lây nhiễm khuẩn với mô sẹo theo phƣơng pháp thổi khô sau nhân nuôi trong môi trƣờng lỏng lắc M1. Song chúng tôi đã không thu đƣợc kết quả chuyển gen mong muốn khi kiểm tra biểu hiện gen
chỉ thị gus-intron với dung dịch X-gluc. Do đó, chúng tôi tiến hành hƣớng
nghiên cứu thứ hai là chuyển mô sẹo sau nhân nuôi sang môi trƣờng cảm ứng tạo chồi Mc sau đó mới tiến hành lây nhiễm khuẩn. Ở thời gian biến nạp 10
phút các mô sẹo ở cả hai chủng vi khuẩn đều không thu đƣợc mẫu có biểu
hiện gen gus. Trong khi đó ở thời gian nhiễm khuẩn 30 phút, mẫu có biểu
hiện gen gus xuất hiện ở cả hai công thức với hai chủng khuẩn nghiên cứu. Tỉ
lệ biểu hiện gen gus trên mô sẹo đạt 31,67% với chủng CV58C1 và 11,67%
khi sử dụng chủng EHA1300. Khi sử dụng hai chủng vi khuẩn này với ngƣỡng thời gian nhiễm khuẩn là 30 phút, chúng tôi đều thu đƣợc các chồi mía sống sót trên môi trƣờng chọn lọc (với CV58C1 là 18,57% và EHA1300 là 7,14%).
Bảng 3.4. Kết quả biến nạp gen gus-intron vào cây mía
Chủng vi khuẩn A.tumefaciens Thời gian biến nạp (phút) Tỉ lệ biểu
hiện gen gus
(%) Tỉ lệ mẫu tái sinh (%) Tỉ lệ mẫu sống sót trên môi trƣờng có bổ sung 2 mg/l ppt (%) CV58C1 30 31,67 ± 0,65 81,43 ± 1,56 18,57 ± 1,28 EHA1300 30 11,67 ± 0,89 92,85 ± 0,31 7,14 ± 0,69
Nhƣ vậy, bƣớc đầu chúng tôi đã thu đƣợc kết quả khi tiến hành chuyển
gen gus vào cây mía thông qua mô sẹo theo phƣơng pháp cảm ứng tạo chồi.
Tuy nhiên do thời gian có hạn, các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả chuyển gen vẫn chƣa hoàn toàn đƣợc tối ƣu. Mặc dù vậy, việc thu đƣợc các mô sẹo tái
sinh có biểu hiện của gen chỉ thị gus đã cho thấy việc sử dụng công nghệ
RNAi để tạo cây mía chuyển gen làm tăng khả năng tích trữ đƣờng trong cây mía là một hƣớng đi triển vọng trong tƣơng lai.
Hình 3.9. Biến nạp gen gus-intron vào cây mía ROC10 in vitro
thông qua trung gian A.tumefaciens
Mô sẹo biến nạp trên môi
trƣờng đồng nuôi cấy Mc nhuộm với dung dịch X-gluc Mô sẹo biểu hiện gus khi
Mô sẹo tạo chồi trên Mc có bổ sung 500 mg/l cefotaxime Chồi cây trên môi trƣờng chọn lọc
Mr có bổ sung 500 mg/l cefotaxime và 2 mg/l ppt
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
KẾT LUẬN:
1. Phân lập đƣợc đoạn gen mã hoá Invertase có kích thƣớc khoảng 435 bp
từ giống mía ROC1 in vitro xúc tác quá trình phân huỷ sucrose.
2. Thiết kế đƣợc vector chuyển gen INV-RNAi ức chế sự biểu hiện của
Invertase và biến nạp thành công chủng vi khuẩn A.tumefaciens
CV58C1.
3. Chọn lọc một số môi trƣờng thích hợp tái sinh cây mía thông qua mô
sẹo (môi trƣờng tạo mô sẹo M1, môi trƣờng tạo chồi Mc, môi trƣờng
tạo rễ Mr) và bƣớc đầu chuyển gen chỉ thị gus-intron vào cây mía.
ĐỀ NGHỊ:
Tiến hành chuyển vector ức chế biểu hiện mã hóa Invertase (INV- RNAi) ở cây mía nhằm tăng trữ lƣợng đƣờng của các giống mía ở Việt Nam.
BÀI BÁO CỦA TÁC GIẢ
CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN ĐÃ ĐƢỢC CÔNG BỐ
Lƣu Thị Cƣ,Đỗ Tiến Phát, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình, Lê Quỳnh
Liên (2009) Phân lập và thiết kế vector ức chế biểu hiện gen mã hoá
Invertase (-fructofuranosidase) ở cây mía. Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc_Thái Nguyên, tháng 11 năm 2009.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Quyết định số 26/2007/QĐ-TTg, về việc phê duyệt “Quy hoạch phát triển
mía đường đến năm 2010 và định hướng đến năm 2020”.
2. Hoàng Thị Sản (2003) Phân loại học thực vật. Nxb Giáo dục
3. Trần Văn Sỏi (2003) Cây mía. Nhà xuất bản Nghệ An.
4. Đỗ Năng Vịnh (2007) Công nghệ can thiệp RNA (RNAi) gây bất hoạt gen
và tiềm năng ứng dụng to lớn. Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(3): 265-275.
5. Vũ Văn Vụ (1999) Sinh lí thực vật ứng dụng. Nxb Giáo dục.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
6. Avigad G and Dey PM (1997) Carbohydrate metabolism: storage
carbohydrates. Plant biochemistry Acedemic Press Ltd, pp: 143-204.
7. Balibrea ME, Rus-Alvarez AM, Bolarin MC, Perez-Alfocea F (1997) Fast
changes in soluble carbohydrates and proline content in tomato seedlings in response to ionic and nonionic iso-osmostic stress, J. Plant physiol. (151): 222-226.
8. Baulcomble D (2004) RNA silencing in plants. Nature 431 (7006): 356-63.
9. Chen S, Hajirezaei M, Bornke F (2008) Differential expression of sucrose
phosphate synthase isoenzymes in tobaco reflects their functional specialization during dark governed starch mobilization in source leaves.
Plant Cell Environ. 31(1): 165-76 elegans. Nature. 391: 806-811.
10. Geigenberger P, Reimholz R, Deiting U, Sonnewald U and Stitt M (1999)
Decreased expression of sucrose phosphate Synthase Strongly inhibits the water stress-induced synthesis of sucrose in growing potato tubers. The plant Journal. 19: 119-129.
11. Groenewald J, Botha FC (2007) Down-regulation of pyrophosphate: fructose 6-phosphate 1-phosphotransferase (PFP) activity in Sugarcane enhances sucrose accumulation in immature internoods. Transgenic Res.
12. Guy CL (1990) Cold acclimation and freezing stress tolerance: role of
protein metabolism. Annu. Rev. Plant physiol. Plant Mol. Biol. 41: 187- 223.
13. Haigler CH, Singh B, Zhang D, Hwang S, Wu C, Cai WX, Hozain M, Kang W, Kiedaisch B, Strauss RE, Hequet EF, Wyatt BG, Jwiden GM, Holaday
AS (2007) Transgenic cotton over-producing spinach sucrose phosphate
synthase showed enhanced leaf sucrose synthesis and improved fiber quality under controlled environmental conditions. Plant Mol Biol. 63 (6): 815-32.
14. Hesse H, Sonnewald U, Willmitzer L (1995) Cloning and expression
analysis of sucrose phosphate synthase from sugar beet (Beta vulgaris L.).
Mol Gen Genet. 247 (4): 515-20.
15. Huber SC. and Huber JL. (1992) Role of sucrose-phosphate Synthase in
Sucrose Metabolism in leaves. Plant physiol. 99: 1275-1278.
16. Huber SC, and Huber JL(1996) Role and regulation of Sucrose phosphate
synthase in higher plants. Annu. Rew. Plant physiol. Plant Mol.Biol. 47: 431-444.
17. Ingram J, Chadler JW, Gallagher L, Salamini F, Bartels D (1997) Analysis
of cDNA clones encoding sucrose-phosphate synthase in relation to sugar