2.3.3.1. Nguyên tắc
Dựa vào cấu tạo của TaqMan probe gồm một đoạn oligonucleotide thẳng cĩ đánh dấu ở đầu 5’ bằng nhĩm “phát” huỳnh quang (report dye), và ở đầu 3’ bằng nhĩm “dập” huỳnh quang (quencher dye) . Probe này cĩ vai trị bắt bổ sung một cách chính xác với vùng nào đĩ trong trình tự nucleotide mà chúng ta cần khuếch đạị Khi ở trạng thái tự do hoặc bắt vào trình tự (nhưng enzyme Taq
polymerase chưa hoạt động) thì một chất huỳnh quang ở đầu này sẽ dập tắt khả năng phát huỳnh quang của đầu kiạ Khi enzyme Taq polymerase tiến hành kéo dài đến một lúc nào đĩ thì nĩ sẽ chạm vào đoạn probe đang bổ sung với một mạch DNẠ Khi đĩ hoạt tính 5’exonuclease của Taq polymerase sẽ tiến hành đánh bật và phân cắt tồn bộ probe cũng như giải phĩng chất huỳnh quang đang bị kìm nén. Chất huỳnh quang này sẽ phát sáng và được đọc bởi máy Realtime- PCR. Do đĩ số lượng bản sao khuếch đại càng nhiều thì cường độ huỳnh quang càng lớn. Từ đĩ ta suy ra được hàm lượng DNA tương ứng với cường độ huỳnh quang mà máy đã đọ
Hình 2.1. Cách thức hoạt động của TaqMan probe
2.3.3.2. Tiến hành
Cho 5 µl mẫu chứng dương (+), chứng âm (-) hoặc dịch DNA tách chiết vào Realtime-PCR mix.
- Đậy nắp tube thật kỹ và đặt vào máy Realtime-PCR.
- Cài đặt chương trình định dạng vị trí các mẫu trong block nhiệt của máy (plate set up), chọn màu huỳnh quang tương ứng. Cài đặt chương trình như sau :
+ 1 chu kỳ: 95 0C – 5 phút. + 40 chu kỳ : 95 0C – 15 giây
60 0C – 1 phút
Sau khi kết thúc chương trình Realtime-PCR, chọn nút Report, chọn chế độ hiển thị tồn phần (amp cycles) và in ra giấy kết quả thí nghiệm. Nếu mẫu dương tính (chu kỳ ngưỡng vượt qua Threshold cycle) thì kết luận là kiểu gen A, B hay C.