Để hiểu cơ chế hoạt động Real-Time PCR, hãy xem đồ thị khuếch đại DNA mẫu (hình 1.3). Trong đĩ, số chu kỳ PCR được thể hiện trên trục x, và tín hiệu huỳnh quang từ phản ứng, tỷ lệ với lượng sản phẩm khuếch đại trong ống, được thể hiện trên trục ỵ
0.3 Pha hàm mũ Giai đoạn bão hịa 0.2 Giá trị ngưỡng 0.1 Đường ngưỡng 0 10 20 30 40
Đồ thị khuếch đại thể hiện 2 giai đoạn, giai đoạn một theo hàm mũ và giai đoạn hai bão hịa khơng theo hàm mũ. Trong giai đoạn hàm mũ, lượng sản phẩm PCR gần như được gấp đơi sau mỗi chu kỳ. Khi phản ứng tiếp diễn, các thành phần phản ứng được sử dụng và sau cùng, một hay nhiều thành phần trở nên cạn kiệt. Từ thời điểm này, phản ứng chậm lại và bước vào giai đoạn bảo hịa (chu kỳ 28-40 trong hình 1.3).
Ban đầu, tín hiệu cịn ở mức tín hiệu nền, và ta khơng thể phát hiện (chu kỳ 1-18 ở hình 1.3) cho dù sản phẩm tăng theo hàm mũ. Đến một thời điểm xác định, sản phẩm khuếch đại đã được tạo ra đủ để tính hiệu huỳnh quang cĩ thể được phát hiện. Và chu kỳ mà tại đĩ điều này xảy ra được gọi là chu kỳ ngưỡng (Cycle of Threshold-CT). Do chu kỳ ngưỡng được đo lường trong giai đoạn hàm mũ khi các thành phần phản ứng chưa cạn kiệt, Real-Time PCR cĩ thể được sử dụng để tính tốn một cách chính xác và tin cậy lượng ban đầu của khuơn mẫu hiện diện trong phản ứng.
Chu kỳ ngưỡng của một phản ứng được xác định chủ yếu bởi lượng khuơn mẫu hiện diện lúc phản ứng khuếch đại ban đầụ Nếu lượng ban đầu của mẫu lớn, chỉ sau một chu kỳ, sản phẩm khuếch đại đã tích lũy đủ cho tín hiệu huỳnh quang cao hơn tín hiệu nền. Vì vậy, phản ứng sẽ trễ hay cĩ chu kỳ ngưỡng caọ Mối quan hệ này là tiền đề cơ bản cho việc định lượng của phương pháp Real-Time PCR [3] .