Trong phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện bằng cách điện di DNA trên gel agrose khi phản ứng kết thúc. Ngược lại, Real- Time PCR cho phép phát hiện sự tích lũy DNA khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra, đĩ là ý nghĩa của cụm từ “Real-Time”.
Khả năng này được thực hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang báo hiệu sự gia tăng lượng DNA tỷ lệ với sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang. Những hĩa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với DNA mạch khuơn gọi là mẫu dị (probe). Những máy luân nhiệt đặc biệt trang bị bộ phận phát hiện huỳnh quang được sử dụng để kiểm sốt tín hiệu huỳnh quang
khi quá trình khuếch đại xảy rạ Tín hiệu huỳnh quang được đo lường phản ánh lượng sản phẩm khuếch đại trong mỗi chu kỳ.
Ưu điểm chính của Real-Time PCR so với PCR truyền thống là nĩ cho phép xác định số lượng bản sao khuơn mẫu ban đầu với sự chính xác và độ nhạy cao trong phạm vi biến thiên rộng. Kết quả Real-Time PCR cĩ thể là kết quả định tính (hiện diện hay vắng mặt một trình tự DNA) hay định lượng (số lượng bản sao DNA). Real Time PCR sử dụng để định lượng DNA được gọi là PCR định lượng. Ngược lại, PCR truyền thống chỉ được xem là bán định lượng. Thêm vào đĩ, dữ liệu Real-Time PCR cĩ thể được đánh giá mà khơng cần phải điện di trên gel, giúp tiết kiệm thời gian và tăng số lượng thí nghiệm thực hiện. Cuối cùng, việc tiến hành phản ứng và đánh giá dữ liệu trong một hệ thống ống đĩng kín giúp làm giảm nguy cơ ngoại nhiễm và loại bỏ những thao tác sau phản ứng khuếch đại[3], [9].