2.2.6.1. Tinh sạch và gắn đoạn cDNA/promoter vào vector tách dòng pBT
Tinh sạch sản phẩm PCR:
Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm.
Bổ sung đệm hòa tan (QG) theo tỉ lệ: Vmẫu : V QG = 1 : 3 ( 1 µl tương ứng với 1 mg mẫu).
Ủ ở 500
C 15 phút trộn nhẹ một lần, sau khi gel tan hết ủ thêm 5 phút cho gel tan hoàn toàn.
Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel Qiaquick spin column, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
Bổ sung thêm 500µl QG, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
Thêm 750µl đệm rửa PE vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
Ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1 phút để loại hết PE.
Hòa tan DNA trong 30 – 50µl H20 khử ion đã được làm ấm đến 500C để ở nhiệt độ phòng 1 phút sau đó ly tâm 13000 v/p trong 1 phút.
Điện di kiểm tra sản phẩm.
Gắn đoạn cDNA/promoter vào vector tách dòng pBT:
Bảng 2.6: Thành phần phản ứng gắn đoạn cDNA/promoter vào vector tách dòng STT Thành phần Thể tích 1 DNA 13 µl 2 Ligation buffer 10X 2 µl 3 Vector pBT 2 µl 4 PEG 4000 2 µl 5 T4 ligase 1 µl Tổng 20 µl
Hỗn hợp trên được ủ ở 22oC trong 2 giờ, sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α.
2.2.6.2. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α
Tạo tế bào khả biến:
Tế bào E.coli DH5α được cấy ra môi trường LB đặc và nuôi qua đêm ở 370C.
Chọn một khuẩn lạc nuôi cấy trong 5 ml LB lỏng, lắc 200 v/p, ở 370
C, qua đêm.
Hút 1% dịch khuẩn ở trên cho vào 50ml LB, lắc 200 v/p, ở 370
C trong 2-3 giờ. Đo OD600nm đạt 0,4 - 0,6 thì chuyển dịch sang cấy ống ly tâm, để 15 phút trong đá (hoặc ở 40
C).
Ly tâm 4000 v/p, ở 40
C, trong 5 phút (lặp lại 3 lần, để trong đá lần thứ hai 30 phút, lần thứ ba 60 phút). Đổ dịch CaCl2, hòa tan trong 1ml CaCl2/100ml LB ban đầu, sau đó bổ sung 15 – 20% glycerol.
Chia 50µl dịch tế bào khả biến vào mỗi ống Eppendorf 2,5ml. Bảo quản tế bào khả biến trong tủ lạnh – 840
C.
Biến nạp:
Bổ sung 5µl vectơ đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ. Hỗn hợp được đặt trong đá 15 phút. Với nhiệt độ lạnh để mẫu trên đá và sau 30 phút đặt ngay hỗn hợp vào bể ổn nhiệt ở 42 0C chính xác 1 phút 30 giây
Sau khi sốc nhiệt, hỗn hợp được đặt ngay vào đá trong thời gian 5 phút.
Bổ sung 150 - 300µl môi trường LB lỏng. Hỗn hợp được nuôi ở 370C, lắc 200 v/p trong vòng 1 giờ.
Sử dụng que cấy trải đã khử trùng trải 150 – 250 µl dịch khuẩn lên đĩa môi trường LB đặc có chứa kháng sinh phù hợp (pBT: 100mg/l ampicillin, X-gal 0,004 ‰, IPTG 100µM; pENTR: 50mg/l kanamicine; pBENDER 50mg/l carbenicillin).
Ủ đĩa petri ở 370
2.2.6.3. Tách chiết plasmid tái tổ hợp
Bảng 2.7: Thành phần hoá chất tách plasmid
Ký hiệu Thành phần
Sol I 50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM ETDA pH8
Sol II 0.2 NaOH, SDS 1%
Sol III 60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml CH3COOH; 28,5 ml H20 Chú ý: Sol I phải khử trùng ở 117oC và giữ ở 4oC [26].
SDS (Sodium dodecyl sulfate) pha mới trước khi dùng
Các bước tiến hành:
Lấy 1 khuẩn lạc nuôi qua đêm ở 370C trong 3ml môi trường LB (có chứa kháng sinh thích hợp).
Lấy 2ml dịch khuẩn nuôi cho vào ống Eppendorf 2ml, ly tâm 8000 v/p trong 2-3 phút.
Loại dịch nổi, thu cặn, sau đó bổ sung 200µl sol I, đảo đều cho tới khi phần cặn tế bào tan hoàn toàn.
Bổ sung 150µl sol II, đảo nhẹ bằng cách đảo ngược ống Eppendorf;
Bổ sung 200µl sol III, đảo nhẹ bằng cách đảo ngược ống Eppendorf, sau đó ly tâm 13000 v/p trong 10 phút.
Thu dịch nổi sau đó bổ sung hỗn hợp chloroform: isoamyl (24 : 1), đảo nhẹ. Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút.
Thu phần dịch nổi sau đó bổ sung isopropanol lạnh theo tỉ lệ 1 : 1.
Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút sau đó thu tủa.
Bổ sung 500µl cồn 70%, lắc nhẹ sau đó ly tâm 13000v/p trong 10 phút.
Lặp lại bước rửa cồn 70%. Thu tủa sau đó làm khô trong thời gian 15- 20 phút.
Tiến hành điện di kiểm tra sản phấm tách plasmid trên gel agarose 0,9%. 2.2.6.4. Phương pháp cắt plasmid Bảng 2.8: Thành phần phản ứng cắt STT Thành phần Thể tích 1 Đệm 10x 1 μl 2 Plasmid 5 μl 3 Enzyme cắt hạn chế 0,5 μl 4 H2O khử ion 3,5 μl 5 Tổng thể tích 10 μl
- Ủ hỗn hợp dung dịch ở 370C trong 2 giờ.
- Điện di kiểm tra kết quả.