Để thu nhận dòng plasmid pBENDER/CCR, hỗn hợn phản ứng LR được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5 bằng phương pháp sốc nhiệt ở 420C. Kết quả thu được một lượng lớn khuẩn lạc trắng trên đĩa thạch LB có chứa kháng sinh carbenicillin 50mg/l.
Vì chủng E.coli DH5 không kháng bất kỳ loại kháng sinh nào, còn vector pBENDER/CCR có gen kháng kháng sinh carbenicillin do đó những khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch có thể là những khuẩn lạc có mang plasmid pBENDER/CCR. Tuy nhiên, không phải tất cả các khuẩn lạc đều mang plasmid pBENDER/CCR mong muốn. Do đó, để chắc chắn rằng cấu trúc pBENDER/CCR có mặt trong các dòng khuẩn lạc, chúng tôi tiến hành phản ứng colony-PCR bằng các cặp mồi đặc hiệu nằm trên đoạn gen. Phương pháp này cho phép phát hiện nhanh những dòng khuẩn lạc mang gen đích, giảm chi phí trong nghiên cứu và tiết kiệm thời gian. Các bước của phản ứng cũng tương tự như phản ứng PCR thông thường nhưng DNA được thay thế bằng dịch tế bào vi khuẩn.
Trước tiên, chúng tôi chọn 10 khuẩn lạc trắng chạy phản ứng colony – PCR với cặp mồi đặc hiệu : CCR entr-F và CCR-R. Theo lý thuyết, với cặp mồi CCR entr F – CCR R thì sản phẩm colony-PCR sẽ cho một phân đoạn DNA có kích thước là 1156 bp.
Hình 3.23. Kết quả colony PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu CCR entr F và CCR R
M: Thang DNA 1kb
Giếng: 1-10: Các dòng khuẩn lạc được đánh số theo thứ tự từ 1-10
Dựa vào kết quả điện di kiểm tra trên hình 3.23, chúng tôi nhận thấy rằng trong 10 dòng được chọn, thì cả 10 dòng đều cho một phân đoạn DNA duy nhất có kích thước khoảng 1156 bp đúng như mong đợi, điều đó chứng tỏ rằng chúng tôi đã biến nạp thành công vector pBENDER/CCR vào tế bào
E.coli DH5.
Để khẳng định một cách chắc chắn hơn các dòng khuẩn lạc này mang plasmid pPENDER/CCR, chúng tôi tiến hành nuôi các khuẩn lạc này trong môi trường LB lỏng có chứa kháng sinh carbenicillin 50 mg/l qua đêm ở 37oC để tách chiết plasmid. Kết quả thể hiện trên hình 3.24.
Hình 3.24. Kết quả tách plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR
M: Thang DNA 1kb
Kết quả trên hình 3.24 cho thấy thu được một lượng lớn sản phẩm tách plasmid là những băng vạch sáng rõ nét, không bị đứt gãy, đảm bảo cho các phản ứng tiếp theo. Để khẳng định một lần nữa, các dòng khuẩn lạc trên là các dòng mang cấu trúc pBENDER/CCR như mong muốn, chúng tôi tiến hành chọn 2 khuẩn lạc trong số các khuẩn lạc trên để kiểm tra phản ứng cắt bởi enzyme giới hạn XhoI. Theo sơ đồ vector pBENDER thì trên vector không có điểm cắt của enzyme XhoI, tuy nhiên trên đoạn cDNA của gen CCR có hai điểm cắt của enzyme XhoI. Do đó sản phẩm thu được sau khi xử lý với enzyme XhoI sẽ cho hai phân đoạn DNA có kích thước như trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kích thƣớc các phân đoạn thu đƣợc khi cắt plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR bằng XhoI
Mẫu pBENDER/CCR
Phân đoạn 1 828 bp
Phân đoạn 2 ~ 8000 bp
Plasmid được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% và được trình bày trên hình 3.25:
Hình 3.25. Kết quả cắt plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR bằng enzyme XhoI
M: Thang DNA 1kb; Giếng 1 – 2: Các dòng khuẩn lạc Giếng 3 -4 (Đối chứng): Sản phẩm colony-PCR
Từ kết quả trên hình 3.25, chúng tôi thấy sản phẩm của phản ứng cắt thu được các phân đoạn có kích thước đúng như dự tính. Điều này thêm một lần nữa khẳng định các dòng khuẩn lạc 1 và 2 mang cấu trúc vector chuyển gen CCR như mong muốn. Kết quả này cho thấy chúng tôi đã thiết kế thành công vector chuyển gen mang đoạn cDNA của gen CCR tách dòng từ mô xylem của cây bạch đàn Eucalyptus urophylla S.T. Blake.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
I. KẾT LUẬN
1. Tách dòng thành công đoạn promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) từ cây bạch đàn uro (Eucalyptus
urophylla S.T Blake). Kết quả phân tích cho thấy promoter có chứa các trình
tự đặc trưng của một promoter CAATBOX, GATABOX, TATABOX và các trình tự đặc trưng biểu hiện cho tầng xylem bao gồm MYBPLANT và MYB1AT. Trình tự này đã được đăng kí trên ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số FN393045.
2. Tách dòng thành công gen mã hóa cho enzyme cinnamoyl CoA reductase từ mô xylem của cây bạch đàn uro (Eucalyptus urophylla S.T Blake). Xác định được trình tự cDNA của gen CCR có kích thước 1156bp và đăng ký trên ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số FN554865.
3. Phân tích độ tương đồng đoạn cDNA của gen CCR của cây bạch đàn uro với 26 trình tự cDNA của gen CCR phân lập từ các loài thực vật khác nhau cho thấy sự đa dạng về trình tự cDNA của gen CCR giữa các loài thực vật, đặc biệt là trình tự cDNA của gen CCR phân lập được từ cây bạch đàn uro, gunnii và saligna.
4. Thiết kế thành công vector chuyển gen ở thực vật mang đoạn gen mã hóa cho enzyme cinnamoyl CoA reductase (CCR) từ cây bạch đàn uro
(Eucalyptus urophylla S.T Blake).
II. KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu hoạt động của promoter CAD trên cây mô hình (thuốc lá, Arabidopsis) để khẳng định sự biểu hiện đặc hiệu trong xylem của promoter này. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2. Chuyển cấu trúc pBENDER/CCR vào cây mô hình (thuốc lá,
Arabidopsis) để nghiên cứu chức năng của gen CCR tách dòng từ cây bạch
đàn uro (Eucalyptus urophylla S.T Blake).
3. Từ kết quả thu được từ cây mô hình có thể sử dụng promoter và vector chuyển gen này cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm cải thiện chất lượng gỗ của các cây lâm nghiệp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TRONG NƢỚC
1. Lê Mộng Chân, Lê Thị Huyên (2000), Thực vật rừng. NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 311- 317.
2. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2005). Sinh học phân tử. Nxb Giáo Dục, tr101-112. 3. Trần Duy Hưng, Đỗ Ngọc, Nguyễn Thị Chương (1991), Cây rừng. Trường
công nhân Kỹ thuật Lâm nghiệp 4, Bộ Lâm nghiệp, tr. 96 – 100.
4. Nguyễn Dương Tài (1994). Bước đầu khảo nghiệm xuất xứ bạch đàn
Eucalyptus urophylla S.T. Blake tại vùng nguyên liệu giấy trung tâm Bắc
Bộ, Việt Nam. Luận án PTS khoa học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm
nghiệp Việt Nam.
5. Nguyễn Kim Thanh, Nguyễn Thuận Châu (2005), Giáo trình Sinh lý thực vật. NXB Hà Nội, tr 214 – 221.
6. Hà Văn Tuế (1993), Nghiên cứu cấu trúc và năng suất của một số quần xã
rừng trồng nguyên liệu giấy tại vùng trung du Vĩnh Phú. Tóm tắt luận án tiến sĩ
sinh học. Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Hà Nội, 24 trang.
TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI
7. A. Baghdady, A.-S. Blervacq, L. Jouanin, J. Grima-Pettenati, P. Sivadon, S. Hawkins (2006), Eucalyptus gunnii CCR and CAD2 promoters are active in lignifying cells during primary and secondary xylem formation in
Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry 44, pp. 674–
683.
8. Aldwin M. Anterola, Norman G. Lewis (2002), Trends in lignin modification: a comprehensive analysis of the effects of genetic
manipulations/mutations on lignification and vascular integrity.
Phytochemistry 61 (2002) 221–294.
9. Artem Evdokimov, DNA cloning for protein expression using Gateway©
10.Barakat A., Bagniewska-Zadworna A., Choi A., Plakkat U., DiLoreto D.S., Yellanki P., Carlson J.E. (2009), The cinnamyl alcohol dehydrogenase gene family in Populus: phylogeny, organization, and
expression. BMC Plant Biology. 9(26): 1-15.
11.Chiang, V. L., (2006). Understanding Gene Function and Control in
Lignin Formation in Wood. NABC Report.
12.Ellen McCrady (1991), The Nature of Lignin. Volume 4, number 4. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
13.Feuillet C., Lauvergeat V., Deswarte C., Pilate G., Boudet A., and Grima P.J. (1995), Tissue- and cell-specific expression of a cinnamyl alcohol
dehydrogenase promoter in transgenic poplar plants. Plant Molecular
Biology. 4(27): 651-667.
14.Fiona S. Poke1, René E. Vaillancourt, Robert C. Elliott and James B. Reid (2003), Sequence variation in two lignin biosynthesis genes, cinnamoyl CoA reductase (CCR) and cinnamyl alcohol dehydrogenase 2 (CAD2).
Molecular Breeding 12: 107–118, 2003.
15.Gawel N. J. and Jarret R. L. (1991), A modified CTAB DNA extraction
procedure for Musa and Ipomoea. Plant Molecular Biology Reporter.
3(9): 262-266.
16. Goicoechea M., Lacombe E., Legay S., Mihaljevic S., Rech P., Jauneau A., Lapierre C., Pollet B., Verhaegen D., Chaubet G.N., Grima P.J. (2005), EgMYB2, a new transcriptional activator from Eucalyptus xylem,
regulates secondary cell wall formation and lignin biosynthesis. The Plant
Journal. 43(4): 553-567.
17.Hai L., Qingyin Z., Yan L.Z., Shasheng W. and Xiangning J. (2003),
Xylem specific expression of a GRP1.8 promoter: 4CL gene construct in
transgenic tobacco. Plant Growth Regulation. 41: 279-286.
18. Hawkins S., Samaj J., Lauvergeat V., Boudet A., and Pettenati J. C. (1997), Cinnamyl alcohol dehydrogenase: Identification of new sites of
19. Hu W.J., Harding S.A., Lung J., Popko J.L., Ralph J., Stokke D.D., Tsai C.J. & Chiang V.L. (1999), Repression of lignin biosynthesis promotes
cellulose accumulation and growth in transgenic trees. Nature
Biotechnology. 17: 808-812.
20. Johan Wadenback, Sara von Arnold, Ulrika Egertsdotter, Michael H. Walter, Jacqueline Grima-Pettenati, Deborah Goffner, Goran Gellerstedt, Terry Gullion, David Clapham (2008), Lignin biosynthesis in transgenic Norway spruce plants harboring an antisense construct for cinnamoyl
CoA reductase (CCR). Transgenic Res (2008) 17:379–392
21. Kim S.J., Kim M.R., Bedgar D.L., Moinuddin S.G., Cardenas C.L., Davin L.B., Kang C., Lewis N.G. (2004), Functional reclassification of the
putative cinnamyl alcohol dehydrogenase multigene family in
Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences.
101:1455-1460.
22. Simon Hawkins, Jozef Samaj, Virginie Lauvergeat, Alain Boudet, and Jacqueline Crima-Pettenati (1997), Cinnamyl Alcoholl Dehydrogenase:
Identification of New Sites of Promoter Activity in transgenic Poplar.
Plant Physiol 113: 321-325.
23. Lauvergeat V., Rech P., Jauneau A., Guez C., Coutos T.P. and Grima P.J. (2002), The vascular expression pattern directed by the Eucalyptus gunnii cinnamyl alcohol dehydrogenase EgCAD2 promoter is conserved among
woody and herbaceous plant species. Plant molecular biology. 50(3): 497-
509. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
24. Matthieu Chabannes, Abdellah Barakate, Catherine Lapierre, Jane M. Marita, John Ralph, Michel Pean, SaoEda Danoun1, Claire Halpin, Jacqueline Grima-Pettenati and Alain Michel Boudet1 (2001), Strong decrease in lignin content without significant alteration of plant development is induced by simultaneous down-regulation of cinnamoyl CoA reductase (CCR) and cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) in
tobacco plants. The Plant Journal (2001) 28(3), 257±270.
26.Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989). Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. Vol. 1, 2, and 3. Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, New York.
27. Simon Hawkins, Jozef Samaj, Virginie Lauvergeat, Alain Boudet, and Jacqueline Crima-Pettenati (1997), Cinnamyl Alcoholl Dehydrogenase:
Identification of New Sites of Promoter Activity in transgenic Poplar.
Plant Physiol 113: 321-325.
28. Tsutomu Kawasaki, Hisako Koita, Tomoyuki Nakatsubo, Kana Hasegawa, Kenichi Wakabayashi, Hiroki Takahashi, Kenji Umemura,
Toshiaki Umezawa, and Ko Shimamoto (2005), Cinnamoyl-CoA
reductase, a key enzyme in lignin biosynthesis, is an effector of small
GTPase Rac in defense signaling in rice. PNAS vol. 103 no. 1, pg. 230–
235.
28. Whettena R. and Sederoffa R. (1995), Lignin Biosynthesis. The Plant Cell 7: 1001-1013.
29. Xu Q., Wen X.P., and Deng X.X. (2004), A Simple Protocol for Isolating Genomic DNA from Chestnut Rose (Rosa roxburghii Tratt) for RFLP and
PCR Analyses. Plant Molecular Biology Reporter. 22: 301a-301g.
TÀI LIỆU WEB
30. http://www.ncbi.nlm.nih.gov
31.http://www.community.h2vn.com/index.php?action=printpage%3Btopic= 061.0.
32. http://vi.wikipedia.org/wiki/Xylem.
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn hoàn toàn trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác.
Tác giả
Lê Phương Dung
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Hữu Cường – Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS. TS. Lê Trần Bình, TS. Chu Hoàng Hà - Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện và đóng góp những ý kiến quý báu cho tôi trong thời gian thực tập tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm Khoa Sinh – KTNN cùng toàn thể cán bộ nhân viên trong khoa đã tạo mọi điều kiện và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn CN. Hoàng Hà và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Cùng với lòng biết ơn sâu sắc gửi tới gia đình và bạn bè đã giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện thành công luận văn này. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thái Nguyên, ngày 09 tháng 9 năm 2009
Học viên
Lê Phương Dung
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
bp : base pair
cDNA : Complementary DNA
DNA : Deoxyribonucleic Acid
DEPC : Diethyl pyrocarbonate
dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate
E.coli : Escherichia coli
EDTA : Ethylen dimine tetra acetic acid
g/l : Gam/lít IPTG : Isopropylthio-beta-D-galactoside Kb : Kilobase kDa : KiloDalton LB : Luria Bertani mg/l : miligam/lít OD : Optical density
PCR : Polymerase Chain Reaction
RNA : Ribonucleic Acid
RNase : Ribonuclease
SDS : Sodium dodecyl sulphate
TAE : Tris - Acetic acide - EDTA
Taq polymerase : Thermus aquaticus polymerase
TE : Tris – EDTA
v/p : vòng/phút
X-gal : 5-brom- 4-chloro-3-indolyl--D-galactosidase
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
---
LÊ PHƢƠNG DUNG
PHÂN LẬP PROMOTER CỦA GEN MÃ HÓA CHO ENZYME CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE (CAD) VÀ THIẾT KẾ
VECTOR CHUYỂN GEN MANG ĐOẠN GEN MÃ HÓA CHO ENZYME CINNAMOYL CoA REDUCTASE (CCR) TỪ CÂY BẠCH
ĐÀN URO (EUCALYPTUS UROPHYLLA S.T. BLAKE)
CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN MÃ SỐ: 60.42.70
LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Hữu Cường (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần dung dịch đệm tách chiết ... 17 Bảng 2.2: Thành phần dung dịch đệm tách chiết ... 19 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng khử DNA... 20 Bảng 2.4A: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ... 21 Bảng 2.4B: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ... 21
Bảng 2.4C: Chu trình nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA ... 21
Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR... 22
Bảng 2.6: Thành phần phản ứng gắn gen/promoter vào vector tách dòng ... 24
Bảng 2.7: Thành phần hoá chất tách plasmid ... 26 Bảng 2.8: Thành phần phản ứng cắt ... 27 Bảng 2.9: Thành phần phản ứng colony-PCR ... 27 Bảng 2.10. Thành phần phản ứng ghép nối ... 29 Bảng 2.11. Thành phàn phản ứng cắt plasmid pENTR/CCR ... 31 Bảng 2.12. Thành phần phản ứng LR ... 31 Bảng 2.13. Thành phần phản ứng cắt plasmid pBENDER/CCR ... 31
Bảng 3.1: Trình tự và các thông số cần thiết của các mồi ... 32
Bảng 3.2: Trình tự và các thông số cần thiết của hai mồi CCR entr-F, CCR-R ... 47
Bảng 3.3. Kích thước các phân đoạn thu được khi cắt plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR bằng XhoI... 58
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Đơn vị cấu trúc cơ bản của lignin ... 8
Hình 1.2: Sinh tổng hợp lignin trong thực vật ... 9
Hình 1.3: Lát cắt thân cây chuyển gen CCR.H (A) và cây không chuyển gen (B) ... 13
Hình 2.1: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ... 23
Hình 2.2: Sơ đồ vector pBT ... 24
Hình 2.3: Chu trình nhiệt của phản ứng colony-PCR ... 28
Hình 2.4. Sơ đồ vector pENTRTM /D-TOPO ... 28
Hình 2.5. Sơ đồ vector pBENDER ... 30
Hình 3.1: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách DNA từ gỗ bạch đàn ... 33
Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 ... 34
Hình 3.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 ... 35
Hình 3.4: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 sau tinh sạch ... 36
Hình 3.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 sau tinh sạch ... 36
Hình 3.6: Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến ... 37
Hình 3.7: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc ... 39
Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc ... 40