10 dòng khuẩn lạc chứa đoạn promoter CAD1 và 1 khuẩn lạc chứa đoạn promoter CAD2 được lựa chọn sau đó nuôi trong môi trường LB lỏng và tách plasmid, đây là phương pháp khá đơn giản nhưng có độ tinh sạch khá cao. Plasmid được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết quả điện di plasmid tinh sạch được trình bày trên hình 3.9:
Hình 3.9: Ảnh điện di plasmid tái tổ hợp tách từ tế bào E.coli DH5α
Giếng M: Thang DNA 1 kb; Giếng 1 – 10: Các dòng khuẩn lạc
Kết quả điện di trên hình 3.9 cho thấy các plasmid tái tổ hợp đều có 3 băng rõ nét và không bị đứt gãy. Để kiểm tra sự có mặt của các đoạn promoter CAD1 và CAD2 trong các plasmid tái tổ hợp chúng tôi tiến hành xử lý plasmid thu được bằng enzyme cắt giới hạn BamHI.
Kiểm tra sự có mặt của promoter trong plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn: Theo lý thuyết trong sản phẩm thu được sẽ có hai phân đoạn DNA:
Thứ nhất là đoạn promoter CAD1, CAD2 cần chèn.
Thứ hai là vector pBT.
Kết quả điện di sản phẩm cắt được thể hiện trên hình 3.10 và 3.11:
Hình 3.10: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter CAD1
Kết quả điện di như hình 3.10 cho thấy sản phẩm cắt phân thành hai băng tương ứng với phần vector pBT có kích thước 2705 bp và đoạn promoter CAD1 khoảng 987 bp. Như vậy có thể bước đầu kết luận chúng tôi đã thu được dòng khuẩn có chứa plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter CAD1. Để chắc chắn đây có phải là chính xác đoạn promoter CAD1 mong muốn, chúng tôi lựa chọn plasmid tách từ dòng số 9 để xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM®
3100 Avant Genetic Analyzer.
Hình 3.11: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter CAD2
Giếng M : DNA 1 kb; Giếng 1 : plasmid tách từ dòng số 6; (+) : Sản phẩm colony-PCR từ dòng số 6
Kết quả điện di như hình 3.11 cho thấy sản phẩm cắt phân thành hai băng rõ nét tương ứng với phần vector pBT khoảng 2705 bp và đoạn promoter CAD2 khoảng 1149 bp. Như vậy có thể có thể bước đầu khẳng định chúng tôi đã tạo được dòng khuẩn có chứa plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter CAD2. Để chắc chắn đây chính xác là đoạn promoter mong muốn, chúng tôi đã mang dòng khuẩn số 6 đi đọc trình tự.