Trong chẩn đoán bệnh cúm gia cầm, việc phân lập và xác định virus là điều bắt buộc và cực kỳ quan trọng. Bệnh phẩm đầu tiên được lấy là dịch thẩm xuất khí quản hoặc hậu môn của gà bệnh được nuôi cấy trong môi trường có hàm lượng kháng sinh cao. Phương pháp đơn giản nhất là phân lập virus qua phôi gà, cụ thể như sau:
Lấy 0,2-0,3ml nước bệnh phẩm tiêm vào túi khí của phôi gà 10-11 ngày tuổi, hàn lại và tiếp tục cho ấp. Các phôi bị tạp khuẩn sẽ chết sau 24 giờ và phải được bỏ đi. Số ít phôi sống còn lại sau 24 giờ được tiếp tục theo dõi đến 72 giờ. Có thể lấy nước phôi từ những phôi chết trong khoảng 48 giờ và sau 48 giờ hoặc từ phôi chưa chết đến khoảng 72 giờ vào việc xác định virus. Đây là thời gian mà số lượng virus cúm (nếu có) đã đạt đến mức cao cần thiết. Để xác định virus phân lập được có phải là virus cúm gia cầm hay không ta dùng phương pháp ngưng kết hồng cầu (HA). Nếu phản ứng HA không cho kết quả dương tính thì tiếp tục lấy nước phôi đó tiêm truyền lần hai vào phôi gà 10 – 11 ngày tuổi và sau đó lại dùng phản ứng HA để kiểm định lại. Nếu kết quả vẫn là âm tính thì tiến hành nuôi cấy trên tế bào một lớp xơ
phôi gà hoặc tế bào thận chó trong điều kiện môi trường nuôi cấy không có trypsin sẽ cho kết quả tin cậy (OIE, 2005) [46].
Phương pháp phổ biến nhất và cho kết quả nhanh nhất thường dùng hiện nay là sử dụng phản ứng RT - PCR (Reverse Transcription PCR): Lấy mẫu bệnh phẩm như phân, gan, lách, thận, dịch thẩm xuất, dịch ngoáy họng của gia cầm rồi sử dụng phản ứng RT - PCR để phân lập và giám định virus trong các phòng thí nghiệm đủ tiêu chuẩn.
Ngoài ra có thể sử dụng phương pháp chẩn đoán huyết thanh miễn dịch: Phương pháp ngưng kết hồng cầu (HI) hay phản ứng miễn dịch gắn men ELISA phát hiện kháng thể kháng virus cúm trong máu của gia cầm. Phản ứng này cho kết quả chính xác (95 – 96%), nhanh và sớm bệnh cúm gia cầm.
