KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.3.6Khảo sát độ bền bảo quản đến enzyme urease cố định trên màng chitosan bằng liên kết cộng hĩa trị
bằng liên kết cộng hĩa trị
Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành khảo sát độ bền bảo quản của enzyme urease cố định trên màng chitosan trong nhiều loại dung dịch bảo quản khác nhau như dung dịch đệm photphat cĩ bổ sung EDTA 1mM, dung dịch đệm photphat khơng bổ sung EDTA, dung dịch muối NiSO4 và ống thủy tinh cĩ chứa enzyme cố định để khơ. Mẫu đối chứng là dung dịch enzyme tự do.
0 20 40 60 80 100 120 1 8 15 22
thời gian (ngày)
h o ạ t tí n h u re a s e ( % s o v ớ i h o ạ t tí n h b a n đ ầ u ) ko EDTA EDTA 1mM khơ NiSO4 enzyme tự do
Kết quả thí nghiệm trong hình 3.17 cho thấy sau 3 tuần bảo quản, mức độ giảm hoạt tính của dung dịch khơng bổ sung EDTA thấp nhất, mức độ giảm nhiều nhất là dung dịch NiSO4. Dung dịch cĩ bổ sung EDTA mặc dù khơng tốt như dung dịch khơng bổ sung EDTA, nhưng cĩ khả năng bảo quản tốt hơn so với dung dịch enzyme tự do và ống thủy tinh cĩ chứa enzyme cố định để khơ. Nguyên nhân của hiện tượng này cĩ thể được giải thích là:
Nếu bảo quản enzyme cố định trong mơi trường cĩ EDTA 1mM, điều này cũng tốt. Vì khi đĩ, EDTA sẽ “bắt” những ion kim loại bằng cách ion kim loại sẽ kết hợp với hai nhĩm –COOH cịn lại của EDTA, từ đĩ sẽ hạn chế được khả năng ức chế của ion kim loại cho sự hoạt động của enzyme.
Cơng thức cấu tạo của EDTA-Na2.2H2O
Thực tế một điều rằng nước cất chưa hồn tồn loại bỏ được tất cả các ion kim loại. Do đĩ để đảm bảo độ tin cậy trong tất cả các khảo sát, chúng tơi đã bảo quản enzyme cố định trong dung dịch cĩ chứa EDTA 1mM.
Riêng đối với việc bảo quản trong mơi trường cĩ Ni2+, ở đây khơng phải dung dịch đệm phosphate, vì nếu là dung dịch phosphate, Ni2+ sẽ phản ứng với các ion phosphate tạo kết tủa, làm ảnh hưởng đáng kể đến kết quả của thí nghiệm. Mơi trường chỉ là nước cất cĩ bổ sung NiSO4. Nếu nồng độ Ni2+ thấp, điều này sẽ hỗ trợ cho sự hoạt hĩa trung tâm hoạt động của enzyme cũng là Ni2+. Thế nhưng bảo quản urease cố định trong mơi trường cĩ nồng độ Ni2+ 1mM, sẽ cĩ tác dụng gây ức chế enzyme. Kết quả thí nghiệm của chúng tơi đã chứng minh điều này là cĩ cơ sở. Sau 3 tuần bảo quản, hoạt tính của enzyme cố định gần như là mất hồn tồn.
Qua đồ thị, độ bền bảo quản của enzyme cũng đã thay đổi. Sau 15 ngày, enzyme tự do đã mất đi 50% hoạt tính. Trong khi đĩ, enzyme cố định được bảo quản trong mơi trường đệm cĩ hoặc khơng cĩ EDTA, chỉ mất mất khoảng 30-35% hoạt tính. Điều này cĩ thể giải thích như sau: Trong quá trình bảo quản enzyme, hoạt tính của enzyme urease tự do và cố định đều giảm dần theo thời gian. Tuy nhiên, việc cố định enzyme cĩ thể giúp duy trì hoạt tính của enzyme trong thời gian dài hơn. Hiện tượng giảm dần hoạt tính của enzyme urease tự do theo thời gian là do khi tồn tại trong mơi trường dung dịch, các phân tử enzyme cĩ thể tương tác với nhau, phá vỡ liên kết yếu giữa các tiểu đơn vị hình thành nên cấu trúc bậc 4 của phân tử protein, làm cho cấu trúc bậc 4 của phân tử urease bị phá hủy, enzyme bị vơ hoạt. Khi enzyme được cố định trên màng chitosan, sự cĩ mặt của chất mang đã giúp hạn chế sự tương tác giữa các phân tử enzyme với nhau, do đĩ hoạt tính của enzyme giữ được trong thời gian dài hơn.
Bảng 3.3: Kết quả hằng số tốc độ vơ hoạt enzyme k và thời gian “bán hủy” t1/2 của enzyme urease cố định trong các dung dịch bảo quảnvà enzyme urease tự do
Dung dịch Khơng EDTA Cĩ EDTA Ống thủy tinh chứa enzyme cố định để khơ
NiSO4 Enzyme tự do
t1/2 (ngày) 25.4 26.5 24.1 10.7 23.1
k (ngày)-1 2,73.10-2 2,62.10-2 2,88.10-2 6,49.10-2 3.10-2
Kết quả tính tốn từ đồ thị cho thấy hằng số tốc độ vơ hoạt enzyme k của enzyme urease cố định trong các dung dịch bảo quản (khơng EDTA và cĩ EDTA), của ống thủy tinh chứa enzyme cố định để khơ và enzyme tự do là gần như nhau. Chỉ cĩ trường hợp bảo quản enzyme cố định trong dung dịch NiSO4 hằng số tốc độ vơ hoạt enzyme k rất cao, nghĩa là hoạt tính của enzyme cố định sẽ giảm nhanh chĩng. Điều này hồn tồn phù hợp với những phân tích của chúng tơi ở trên.
rằng nên bảo quản enzyme urease cố định trong dung dịch đệm phosphate cĩ bổ sung EDTA 1mM [17].
CHƯƠNG 4: