Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2Nhân gen LTB và nối với gen 27aa
Để kết hợp với đoạn gen 27 aa trong quá trình nghiên cứu biểu hiện, đoạn gen LTB cũng được nhân lên bằng phản ứng PCR. Trên khuôn là plasmid chứa đoạn LTB, đoạn gen LTB được nhân lên bằng phản ứng PCR với cặp mồi 5’_LTB và 3’_LTB. Kết quả PCR gen LTB được thể hiện trên hình 3.2. Kết quả PCR gen LTB ở giếng số 1 cho thấy một băng rõ nét duy nhất. So sánh với kích thước Marker 1Kb thì đoạn gen được nhân lên có kích thước ~ 300bp, trên lý thuyết đoạn gen LTB cũng có kích thước tương ứng với đoạn gen này. Điều này thể hiện đã nhân bản thành công đoạn gen LTB từ plasmid chứa gen LTB.
Với đoạn gen 27 aa và gen LTB đã nhân bản thành công, chúng tôi tiếp tục nối hai đoạn gen này bằng phản ứng PCR. Với việc gắn thêm 10 nucleotide của trình tự đoạn LTB vào mồi 3’_27aa và 10 nucleotide của trình tự đoạn gen 27 aa vào mồi 5’_LTB chúng tôi hy vọng sẽ nối được hai đoạn gen này với nhau. Phản ứng PCR này thực hiện theo chu trình nhiệt giống phản ứng nhân đoạn gen LTB và thành phần được mô tả ở phần phương pháp nhiên cứu. Kết quả được thể hiện trên hình 3.2.
Hình 3.2. Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn LTB và ghép nối 27aa_LTB M: Marker 1kb 1: đoạn LTB 2: ghép nối 27aa và LTB
Giếng số 2 là sản phẩm ghép nối đoạn gen 27 aa với gen LTB. So sánh kích thước này với kích thước của đoạn LTB và với Marker 1kb cho thấy rằng
1 M 2 M 2 ~300 bp ~390 bp 250 500 bp
sản phẩm PCR nối này có kích thước ~ 390bp. Và đây cũng chính là kích thước được tính theo lý thuyết của đoạn gen nối. Như vậy phản ứng nối đoạn gen 27 aa và đoạn gen LTB thành công.
Sản phẩm nối 27aa_LTB được gắn vào vector pBT và biến nạp vào tế bào khả biến E.Coli DH5α. Sau quá trình chọn lọc và nuôi khuẩn, plasmid từ những mẫu khuẩn đã nuôi được tách và cắt plasmid bằng enzyme cắt hạn chế
BamHI để kiểm tra sự có mặt của đoạn 27aa_LTB. Kết quả của phản ứng cắt được thể hiện trên hình 3.3
Hình 3.3. Điện di sản phẩm cắt plasmid pBT_27aa_LTB A: Sơ đồ vector pBT