Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.6.Biểu hiện đoạn peptit kháng nguyên trong tế bào thực vật
Vector tái tổ hợp pCB_27aa_LTB được biến nạp vào A. Tumefaciens
bằng phương pháp xung điện. Phương pháp này dựa trên cơ sở là sự tạo ra các
pTRA
Lai
Cắt bằng enzyme HindIII 27aa_LTB/BamHI/NotI
BamHI
NotI
pTRA_ 27aa_LTB_cmyc_KDEL
27aa_LTB_cmyc_KDEL/HindIII HindIII
HindIII pCB
pCB_35S_27aa_LTB_cmyc_KDEL
Lai
Chủng DH5α mang cấu trúc biểu hiện (35S_27aa_LTB_cmyc_KDEL)
lỗ trên màng tế bào khi có tác dụng của các điện cực lớn, làm cho các phân tử DNA đi vào tế bào theo điện trường. Tế bào khả biến A. tumefaciens CV58C1 sau khi tan đá thêm 1µl plasmid pCB_27aa_LTB và để trong đá 10 phút. Sau đó tiến hành xung điện ở mức 2,5µF, 400Ω, 25kV. Dịch khuẩn được nuôi phục hồi trong 300µl môi trường LB lỏng ở 28o
C trong 2 ngày, sau đó cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung Rifa (50mg/l) và Kana (50mg/l). Phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu 5’_27aa và 3’_LTB được sử dụng để kiểm tra sự có mặt của plasmid tái tổ hợp trong các dòng tế bào A. tumefaciens sống sót trên môi trường chọn lọc.
Đoạn peptit kháng nguyên của virut VNNB được biểu hiện tạm thời trên tế bào thực vật bằng phương pháp Agro-inflitration. Đầu tiên lấy một khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pCB_27aa_LTB nuôi trong 5ml LB lỏng có bổ sung Rifa (50mg/l) và Kana (50mg/l) ở 28oC. Sau đó dòng tế bào được cấy chuyển với tỉ lệ 1/50 sang môi trường LB lỏng mới có bổ sung kháng sinh tương tự trên và 10µl AS (100mM) và 1ml MES(1M), tiếp tục nuôi lắc qua đêm ở 28oC. Ly tâm 3000 rpm/ 30 phút tại 4oC thu dịch tế bào, sau đó rửa lại tế bào với nước cất vô trùng. Tế bào A. tumefaciens cuối cùng được hòa tan trong dung dịch có chứa: AS, MgCl2, MES với nồng độ cuối cùng tương ứng là 100µM, 10Mm và 10mM. Dịch huyền phù được giữ khoảng 2h ở nhiệt độ phòng trước khi tiêm vào mặt dưới các lá cây thuốc lá 5 tuần tuổi. Mẫu thí nghiệm được thu sau khi tiêm 2 và 4 ngày. Mẫu thu được bảo quản ở tủ - 84oC. Song song, chúng tôi cũng tiến hành biểu hiện tạm thời gen Gus nhằm làm đối chứng cho quá trình Agro-infiltration.