Chả giị sau khi bao gĩi PE được chuyển vào máy rà kim loại, sau đĩ đĩng thùng carton với số lượng 20 gĩi 500 gram/1 thùng carton. Thùng thành phẩm được chuyển sang kho bảo quản cĩ nhiệt độ -35oC giữ nhiệt độ tâm sản phẩm -18oC.
PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
II.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm
II.1.1 Thời gian
Đề tài được thực hiện từ tháng 02/2006 đến tháng 06/2006
II.1.2.Địa điểm
Đề tài được thực hiện tại phịng Kỹ thuật, Xí nghiệp Chế biến Hải sản và Thực phẩm xuất khẩu Cholimex thuộc khu Cơng nghiệp Vĩnh Lộc.
Xí nghiệp kinh doanh các loại mặt hàng thủy hải sản, thực phẩm tinh chế, hàng khơ và thực phẩm chế biến. Xí nghiệp cĩ hơn 1000 cơng nhân lành nghề, các cán bộ cĩ trình độ khoa học kỹ thuật cao, nhà xưởng rộng lớn, máy mĩc thiết bị tiên tiến, xí nghiệp đã khơng ngừng mở rộng thị trường và các mặt hàng, nhiều năm liền đạt danh hiệu “Hàng Việt Nam chất lượng cao”, đồng thời xuất đi nhiều nước trên thế giới: Anh, Pháp, Úc, Nhật… Xí nghiệp cũng đạt được các tiêu chuẩn quản lý chất lượng HACCP, ISO 9001 : 2000 …
Doanh thu xí nghiệp tăng từ 21,75 tỷ đồng năm 2003 lên 47 tỷ đồng năm 2005 và hướng hoạt động của Xí nghiệp trong thời gian tới sẽ cịn phát triển hơn nữa.
II.2. Vật liệu thí nghiệm
II.2.1. Vật liệu
Tất cả các mẫu nguyên liệu, bán thành phẩm, thành phẩm, mẫu nước, nước đá và vệ sinh cơng nghiệp đều được thu nhận, tại phân xưởng chế biến thực phẩm và được xử lý, phân tích ở phịng kỹ thuật của Xí nghiệp Cholimex.
II.2.2. Trang thiết bị, máy mĩc, dụng cụ thí nghiệm
c. Dụng cụ
Dụng cụ lấy mẫu: hộp đựng dụng cụ inox, kéo inox, kẹp inox, muỗng inox, đèn cồn, chai thủy tinh cĩ nắp đậy để lấy mẫu nước, ống nghiệm thủy tinh cĩ nắp chứa 5ml dung dịch salin pepton water, bao PE, bình nhựa cách nhiệt, tăm bơng vơ trùng. Tất cả dụng cụ trên đều vơ trùng.
Dụng cụ xử lý mẫu: thau nhựa, rổ nhựa, kéo inox, kẹp inox, đèn cồn, bao PE. Tất cả đều vơ trùng.
Dụng cụ cấy mẫu: cốc thủy tinh, giá để ống nghiệm bằng inox, đèn cồn, ống nghiệm, que cấy vịng, thẳng, đĩa petri, pipetman, đầu típ 1ml. Tất cả đều vơ trùng.
Dụng cụ pha chế mơi trường: muỗng inox, cốc thủy tinh, chai thủy tinh, ống nghiệm, đĩa petri, ống hút thủy tinh cùng quả bĩp cao su.
d. Máy mĩc, thiết bị
Nồi hấp thanh trùng autoclave Tủ lạnh bảo quản mẫu
Tủ mát giữ mơi trường và các giống vi sinh vật Bể điều nhiệt
Cân điện tử
Máy dập mẫu stomacher Máy vortex Tủ sấy tiệt trùng Tủ ấm 44o C Tủ ấm 37oC Tủ ấm 30oC
II.2.3. Hĩa chất, mơi trƣờng
a. Hĩa chất
- Thuốc P3: Gồm 2 dạng:
P3– oxonia active dùng để ngâm, rửa, sát trùng và xử lý nguyên liệu, bán thành phẩm. Đây là một hĩa chất thanh trùng đặc biệt, tác động nhanh, khơng tạo bọt, cấu tạo từ một kết hợp bền giữa peracetic acid và hydrogen peroxide. Thành phần gồm hydrogen peroxide (H2O2), acetic acid (CH3COOH), peracetic acid (CH3COOOH), chất ổn định và nước đã khử ion. Ở nồng độ sử dụng 0,05% đến 3% thì gần như khơng mùi. Tuy nhiên dạng đậm đặc cĩ mùi rất mạnh và đặc trưng giúp người sử dụng cĩ thể phân biệt ngay so với các hĩa chất khác. Tỷ trọng: 1 lít tương đương 1,11kg, dạng đậm đặc pH = 1.
Tính chất: Thanh trùng cĩ hiệu quả với tất cả các vi sinh vật ngay cả trong điều kiện nước lạnh. Thời gian thanh trùng phụ thuộc vào nồng độ, nhiệt độ và loại vi sinh vật cần tiêu diệt. Nồng độ thường sử dụng 0,05% đến 3% ở nhiệt độ khoảng 5oC – 20oC. Ở nhiệt độ cao tới 50oC thì tăng được hiệu quả khử trùng và giảm được thời gian xử lý. Khơng nên sử dụng ở nhiệt độ quá 50o
C.
Lưu trữ: đựng trong thùng chứa 30kg bằng nhựa cĩ van xả sẽ được bảo quản ít nhất trong một năm nếu tránh được ánh nắng chiếu thẳng ở nhiệt độ (-20o
C) - 35oC.
P3 – triquart dùng để sát trùng dụng cụ, thiết bị, nhà xưởng. P3– triquart là hợp chất ammonium, cĩ thể sử dụng ở nồng độ pH acid yếu đến kiềm nhẹ. Khơng cĩ tác dụng ăn mịn đối với kim loại và các sản phẩm nhựa. Cĩ thể pha trộn với các sản phẩm cĩ tính kiềm và acid để làm tăng hiệu quả tẩy rửa. Cĩ tính tạo bọt cao nên thích hợp với kỹ thuật tẩy rửa bằng thiết bị phun bọt ở áp suất thấp.
- Chlorine: là một chất sát trùng mà cũng là chất độc ăn mịn rất nhanh ở nhiệt độ 900C hay ở nhiệt độ thường nhưng ẩm ướt. Chúng thường được sử dụng ở dạng lỏng, khi hịa tan vào mơi trường sẽ tạo thành những hợp chất chlorine gồm : HOCl, OCl, chloran.Tác dụng diệt khuẩn của chlorine là do những phản ứng của các hợp chất
này tác dụng lên các enzyme của tế bào vi khuẩn làm ngưng tiến trình biến dưỡng. pH, nhiệt độ và thời gian cĩ liên quan đến hiệu quả diệt trùng của chlorine.
Nồng độ của chlorine được kiểm tra bằng giấy kiểm tra chlorine (chlorite papers), giấy được nhúng vào nước chlorine, màu sắc hiện diện trên giấy cho biết nồng độ chlorine tương ứng. Đơn vị sử dụng ppm.
Xí nghiệp Cholimex sử dụng loại chlorine 70% hoạt tính do Mỹ sản xuất. Cách pha chế như sau:
70 Px100 dùng cần (mg) tính hoạt % Chlorine70
Với P (mg) chlorine nguyên chất được tính bằng cách nhân thể tích (V lít) với nồng độ cần pha chế (N mg/lít). Hịa lượng chlorine trên vào một thau nước nhỏ, quậy đều đến khi thuốc hịa tan hồn tồn, sau đĩ pha dung dịch đĩ vào bể sử dụng, cho nước đá vào để làm lạnh theo yêu cầu của quy trình (to 5oC).
b.Mơi trường và thuốc thử
Xí nghiệp Cholimex sử dụng mơi trường tổng hợp của hãng Merck – Đức sản xuất, bao gồm:
- Dung dịch saline pepton water (SPW) - Plate count agar (PCA)
- Trypticase soya agar (TSA) - Violet red bile agar (VRB)
- Brilliant green bile lactose broth (canh BGBL) - Eosin methyl blue agar (EMB)
- Tryptone broth
- MR – VP broth (methyl red – voges proskauer broth) - Simmons citrate agar (SCA)
- Baird parker (BP)
- Huyết tương thỏ đơng khơ - Nước cất vơ trùng
- Thuốc thử methyl red
- Dung dịch - napthol 5% trong cồn tuyệt đối - Dung dịch KOH 40%
II.3. Phƣơng pháp thí nghiệm
II.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu
Trước khi tiến hành lấy mẫu tất cả dụng cụ, bình chứa phải đảm bảo vơ trùng. Nhân viên lấy mẫu phải mặc bảo hộ lao động, đeo khẩu trang, bao tĩc, găng tay sạch và phải sát trùng tay, găng tay trước khi tiến hành lấy mẫu.
d. Lấy mẫu nước
Lấy trực tiếp dưới vịi nước. Vịi được sát trùng cồn, đốt và mở để cho nước chảy khoảng 2 phút. Dùng bình nhựa vơ trùng cĩ nắp đậy lấy khoảng 2/3 chai nước, hơ lại miệng chai trên ngọn lửa đèn cồn rồi đậy nắp, ghi rõ tên mẫu, ngày lấy mẫu, vị trí lấy mẫu và vận chuyển ngay về phịng giữ mẫu hay phân tích bằng bình cách nhiệt.
e. Lấy mẫu thực phẩm và nước đá
Mẫu lấy phải đại diện cho một lơ đồng nhất, lấy đúng yêu cầu kỹ thuật. Dùng bao PE vơ trùng và kéo, kẹp, muỗng lấy mẫu. Hàn miệng bao lại dưới đèn cồn và ghi chú tên mẫu, ngày lấy mẫu rõ ràng. Vận chuyển về phịng lưu mẫu bằng bình nhựa cách nhiệt cĩ ướp đá vảy để đảm bảo nhiệt độ 4oC.
f. Lấy mẫu vệ sinh cơng nghiệp
Dùng tăm bơng vơ trùng, ống nghiệm cĩ nắp nhựa chứa 5ml dung dịch SPW và khuơn nhơm 10cm2 để lấy mẫu. Nhúng tăm bơng vào dung dịch SPW sau khi mở nắp ống nghiệm và hơ dưới ngọn lửa đèn cồn, lấy mẫu vệ sinh trong phần diện tích khuơn
nhơm sau đĩ cho cả tăm bơng vào ống nghiệm. Hơ lại miệng ống nghiệm trên đèn cồn. Ghi chú đầy đủ và vận chuyển về phịng, bảo quản mẫu.
II.3.2. Phƣơng pháp bảo quản mẫu
Tất cả các mẫu sau khi lấy về phải được phân tích ngay. Trong trường hợp khơng phân tích ngay thì mẫu phải được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 0oC – 4oC nhưng khơng được quá 36 giờ.
II.3.3 Phƣơng pháp xử lý mẫu cho phân tích vi sinh
Tất cả các mẫu trước khi tiến hành phân tích vi sinh vật đều phải được xử lý qua các bước:
Bước 1: Cân mẫu: Dùng kéo kẹp vơ trùng mở bao PE chứa mẫu, dùng kéo kẹp vơ trùng khác để lấy mẫu cho vào bao PE và cân.
Bước 2: Thêm dung dịch pha lỗng SPW phù hợp và tiến hành dập mẫu trong 30 giây bằng máy stomacher để được dung dịch mẫu dạng huyền phù nồng độ pha lỗng 1/10.
Bước 3: Từ dạng huyền phù nồng độ pha lỗng 1/10 tiến hành pha lỗng tới các nồng độ 1/100, 1/1000 … tùy vào mức độ nhiễm khuẩn của từng loại mẫu.
Riêng đối với mẫu nước và nước đá sau khi mở nắp hay miệng bao bằng dụng cụ vơ trùng tiến hành lọc qua hệ thống lọc nước vơ trùng. Tất cả vi sinh vật sẽ được giữ lại trên màng lọc.
II. 3.4. Phƣơng pháp phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật
Tất cả các quá trình phân tích đều được thực hiện trong phịng cấy vơ trùng với các dụng cụ sạch khuẩn. Phân tích vi sinh vật theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) 5287/91, Nordic Committee On Food Analysis (NMKL), phương pháp màng lọc, phương pháp ISO 6222, ISO 9308 – 1, ISO 7999 – 2.
II.3.4.1. Phân tích tổng số vi sinh vật hiếu khí (TPC) trong mẫu thực phẩm bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc
Nguyên tắc: Đếm số khuẩn lạc mọc trên mơi trường thạch dinh dưỡng từ một mẫu xác định trên cơ sở xem mỗi khuẩn lục được hình thành từ một tế bào vi sinh duy nhất.
Mơi trường nuơi cấy:
Mơi trường thạch PCA (plate count agar)
Dung dịch nước muối SPW (saline pepton water) Dụng cụ, thiết bị nuơi cây:
Tủ ấm 370C 1oC, máy votex, máy dập mẫu, cân điện tử, đĩa petri, ống nghiệm thủy tinh, pipetman, giá để ống nghiệm, đèn cồn, cốc thủy tinh.
Quy trình phân tích:
Chuẩn bị mẫu: Cân 10g vào bao PE trong điều kiện vơ trùng, thêm vào 90g dung dịch pha lỗng SPW. Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu stomacher trong 30 giây. Mẫu sau khi được đồng nhất ta cĩ nồng độ mẫu là 10-1
.
Dùng pipet vơ trùng chuyển 1ml dịch mẫu đã pha lỗng 10-1 vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha lỗng SPW để được dung dịch mẫu cĩ độ pha lỗng 10-2. Tiếp tục như vậy cho đến khi cĩ nồng độ pha lỗng cần thiết. mong muốn.
Cấy mẫu: Chọn hai hay ba độ pha lỗng liên tiếp dự kiến chứa khoảng 25 – 250 tế bào vi sinh vật trong 1ml để cấy lên đĩa petri. Dùng pipet vơ trùng hoặc pipetman với đầu tip vơ trùng chuyển 1ml dịch mẫu pha lỗng đã chọn vào giữa đĩa petri vơ trùng. Mỗi độ pha lỗng cấy ít nhất 2 – 3 đĩa. Sau khi cấy đổ vào mỗi địa 10 – 15ml mơi trường PCA đã được đun chảy và ổn định ở 45oC. Trộn đều dịch mẫu với mơi trường bằng cách xoay trịn đĩa petri xuơi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3 – 5 lần cho mẫu đồng nhất với mơi trường. Đặt các đĩa trên mặt phẳng ngang cho mơi trường đơng đặc.
Nuơi ủ: Khi thạch đã đơng đặc, lật ngược và ủ các đĩa trong tủ ấm ở nhiệt độ 30oC 1oC trong 72 giờ.
Khẳng định và tính kết quả: Sau 72 giờ nuơi ủ, đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa. Chọn các đĩa cĩ số đếm từ 25 – 250 khuẩn lạc để tính kết quả. Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí trong 1g hay 1ml mẫu được tính như sau:
fi i f nV V n N ml hayCFU g CFU A ... ) / / ( 1 1
Trong đĩ : A : Số đơn vị hình thành khuẩn lạc trong 1g hay 1ml mẫu N : Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
ni : Số lượng đĩa cấy tại độ pha lỗng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa fi : độ pha lỗng tương ứng
II.3.4.2. Phân tích định lƣợng Coliforms trong thực phẩm bằng phƣơng pháp đếm lạc khuẩn
Nguyên tắc:
Mẫu đã đã đồng nhất được cấy một lượng nhất định lên mơi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose và sinh acid sau khi ủ ở 37oC 1oC trong 24 – 48 giờ. Ngồi lactose, mơi trường chọn lọc cho Coliforms cịn chứa muối mật ức chế vi khuẩn gram dương và chất chỉ thị pH như neutral red, crystal violet. Trên mơi trường này khuẩn lạc Coliforms cĩ màu đỏ đến đỏ đậm, đường kính > 0,5mm, xung quanh khuẩn lạc cĩ vùng tủa của muối mật (ảnh 2.1). Việc khẳng định được thực hiện bằng cách cấy chuyển trên mơi trường canh BGBL.
Mơi trường nuơi cấy:
Mơi trường tryptone soya agar (TSA) Mơi trường violet red bile agar (VRB)
Mơi trường canh brilliant green bile lactose broth (BGBL) Dung dịch nước muối SPW
Dụng cụ, thiết bị nuơi cấy:
Đĩa petri, ống nghiệm thủy tinh, giá để ống nghiệm, cốc thủy tinh, đèn cồn, pipetman, đầu tip, máy dập mẫu, máy votex, cân điện tử, tủ ấm 37oC.
Quy trình phân tích:
Chuẩn bị mẫu: Mẫu được đồng nhất hĩa và pha lỗng tương tự như phần định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí sao cho trong 1ml dung dịch pha lỗng chứa khoảng 100 tế bào Coliforms.
Cấy mẫu: chuyển 1ml dịch pha lỗng mẫu đã chọn vào đĩa petri. Đổ vào mỗi đĩa đã cấy khoảng 5ml mơi trường TSA đã được đun chảy và ổn định trong bể điều nhiệt ở 45oC. Lắc trịn đĩa petri xuơi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3 – 5 lần để trộn đều dịch mẫu với mơi trường. Đợi 30 phút – 1 giờ để mơi trường đơng đặc và hồi phục các tế bào bị tổn thương. Bổ sung vào mỗi đĩa 10 – 15 ml mơi trường thạch VRB ở nhiệt độ 45oC lên mơi trường TSA, chờ cho mơi trường trong đĩa đơng đặc, lật ngược và ủ đĩa ở 37oC 1oC trong 24 giờ.
Thử nghiệm khẳng định Coliforms: trong trường hợp mẫu cĩ chứa các nguồn carbon khác khơng phải lactose, để tránh các trường hợp vi sinh vật sử dụng các nguồn carbon trong mẫu để lên men và tạo khuẩn lạc cĩ hình dạng tương tự Coliforms cần thực hiện thêm bước khẳng định: chọn ít nhất năm khuẩn lạc nghi ngờ, dùng que cấy vịng cấy chuyền sang các ống nghiệm chứa mơi trường BGBL. Ủ các ống BGBL ở 37oC 1oC trong 24 giờ. Kết quả khẳng định là dương khi vi khuẩn tăng trưởng làm đục mơi trường và sinh hơi trong ống Durham. Tỉ lệ khẳng định là tỉ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả dương với số khuẩn lạc được dùng trong thử nghiệm khẳng định.
Tính kết quả: dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỉ lệ khẳng định, mật độ Coliforms
được tính theo cơng thức:
A (CFU/g hay CFU/ml) = R
f V n Vf n N i i . . .... 1 1
Trong đĩ: A: Số đơn vị hình thành khuẩn lạc vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu N: tổng số khuẩn lạc đếm được
V: dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa
fi: độ pha lỗng cĩ số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm. R: tỉ lệ khẳng định
Ảnh 2.1: Khuẩn lạc Coliforms trên mơi trƣờng VRB
II.3.4.3. Qui trình định tính E. coli trong thực phẩm
Nguyên tắc: Phương pháp này dùng để định tính và kết luận phát hiện hay khơng phát hiện E. coli trong một khối lượng mẫu xác định.
Cấy mẫu vào mơi trường tăng sinh BGBL, phân lập trên mơi trường EMB và khẳng định bằng các thử nghiệm trong nghiệm pháp IMVIC.
Dung dịch pha lỗng và mơi trường:
Dung dịch saline pepton water (SPW) Brilliant green bile lactose broth (BGBL)
Thạch eosin methylene blue lactose agar (EMB) Thạch tryptone soya agar (TSA)
Canh methyl red voges proskauer (MR – VP) Canh tryptone (hoặc peptone)
Thạch simmons citrate. Thuốc thử methyl red 0,2% Dung dịch KOH 40%
Thuốc thử - napthol 5% Thuốc thử Kovac’s
Dụng cụ - thiết bị:
Đĩa petri, ống nghiệm, đèn cồn, pipetman, đầu tip, cốc thủy tinh, máy dập mẫu, máy votex, cân điện tử, tủ ấm 37,0 1,.0oC và tủ ấm 44 0,5oC.