Dựa trên khả năng biến tính và hồi tính của DNA cùng với sự tìm ra enzyme Taq-polymerase (1 loại DNA polymerase chịu nhiệt), người ta đã thiết lập được hàng loạt các chuỗi phản ứng nhân đôi DNA in vitro trong một thời gian ngắn. Khi ta làm biến tính (đun nóng) để đoạn DNA tách ra thành 2 mạch đơn và cung cấp 2 mồi (primer) chuyên biệt gồm mồi xuôi và mồi ngược bắt cặp bổ sung với 2 đầu của
đoạn DNA cần nhân lên thì Taq-polymerase sẽ tổng hợp nên 2 sợi DNA mới. Như
vậy nếu phản ứng nhân đôi DNA trên được lặp lại liên tục nhiều lần thì ta sẽ thu
được 1 lượng khuyếch đại rất lớn của đoạn DNA cần nghiên cứu. Phản ứng PCR gồm có nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: là giai đoạn biến tính (denaturation), nhiệt độ được nâng lên 93 - 100 oC. Ở nhiệt độ này tất cả các mạch xoắn kép của DNA đều được tách ra.
- Giai đoạn 2: là giai đoạn bắt cặp (hybridization), nhiệt độ phản ứng
được hạ xuống thấp hơn nhiệt độ nóng chảy - Tm của các primer (là nhiệt độ mà tại
DNA khuôn mẫu. Mức nhiệt độ dao động khoảng 40 - 70oC, tuỳ thuộc vào Tm của các primer và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.
- Giai đoạn 3: là giai đoạn kéo dài (extension), nhiệt độ được nâng lên 68 - 72oC. Ở nhiệt độ này Taq - polymerase hoạt động tốt nhất để kéo dài các mạch DNA. Đoạn DNA nằm giữa 2 primer được tổng hợp.
Cứ sau 1 chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên, từ 1 DNA khuôn mẫu sẽ tạo ra được 2 DNA mới. Và sau mỗi lần lặp lại sẽ làm tăng gấp đôi lượng DNA mẫu của lần trước (tăng theo cấp số nhân).
Hình 2.7: Phản ứng PCR.
Chú thích: (A): giai đoạn biến tính (B): giai đoạn bắt cặp (C): giai đoạn kéo dài
Tổng số DNA khuếch đại sau phản ứng PCR được tính theo công thức: Tổng DNA khuếch đại = m * 2n
2.8.2 Các yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR
2.8.2.1 Dung dịch đệm (Buffer)
Dung dịch đệm có tác dụng cung cấp lực ion (ionic strength) cần thiết cho phản ứng xảy ra. Nồng độ các chất, pH của dung dịch đệm tùy thuộc vào nguồn enzyme DNA polymerase được dùng. Các thành phần của một dung dịch đệm điển hình gồm: KCl, MgCl2, gelatin và Tris – HCl (pH 8,5 ở nhiệt độ phòng).
2.8.2.2 Mg2+
Nồng độ Mg2+ là yếu tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR. Nó làm tăng hoạt động của DNA polymerase, tăng Tm của DNA và sự tương tác giữa primer - nhiệt độ. Nồng độ Mg2+trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng thường biến thiên trong khoảng từ 0,5 đến 5 mM. Nồng độ MgCl2 từ 1,5 đến 2 mM thường được xem là tối
ưu, nhưng nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử
nghiệm (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).
Nồng độ Mg2+ cao sẽ làm phân tử dây đôi ổn định hơn, kềm hãm sự biến tính hoàn toàn của các sợi đôi, làm cho kết quả PCR ít đi. Sự dư thừa Mg2+ còn làm cho hiện tượng bắt cặp giả xảy ra nhiều hơn. Hiện tượng này làm primer bắt cặp ở những vị trí không chuyên biệt trên DNA khuôn tạo ra những sản phẩm không mong muốn với số lượng khá lớn.
Ngược lại nếu nồng độ Mg2+ quá thấp (< 0.5 mM), thì quá trình kéo dài sẽ
xảy ra không hoàn toàn, tạo ra những sản phẩm DNA ngắn hơn bình thường. Đó là do trong phản ứng PCR, Mg2+đóng vai trò Co – factor của Taq polymerase nên nếu lượng Mg2+ quá thấp thì Taq polymerase sẽ không thể hoạt động bình thường trong giai đoạn kéo dài (Bùi Chí Bửu, 1999).
2.8.2.3 Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs)
Là nguyên liệu cần thiết cho phản ứng tổng hợp DNA. Hỗn hợp dNTPs gồm 4 loại: dATP, dTTP, dCTP, dGTP và thường được sử dụng ở nồng độ 20 - 200 µM cho mỗi nucleotide. Điều quan trọng là chúng ta phải giữ cho nồng độ của cả 4 dNTPs bằng nhau vì sự mất cân bằng thành phần các nucleotide sẽ làm tăng lỗi sao chép của DNA polymerase.
2.8.2.4 Primer (đoạn mồi)
Primer là một trong những yếu tố quan trọng nhất, ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả cũng như độ chuyên biệt của phản ứng PCR. Chọn primer là giai đoạn quyết định của phản ứng PCR và cần tuân theo một số nguyên tắc sau:
- Primer cho 1 phản ứng PCR gồm có 1 primer xuôi (forward) và 1 primer ngược (reverse). Xuôi và ngược là so với chiều sao mã. Trong hầu hết các
ứng dụng phản ứng PCR, 2 primer xuôi và ngược đều phải có nồng độ bằng nhau. - Trình tự của primer được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa 2 primer hay giữa 1 primer với chính nó (trình tự của chúng không được bổ
sung nhau).
- Tm của 2 primer không cách xa nhau.
- Trình tự của primer phải đặc trưng cho trình tự của DNA được khuyếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen. Trình tự giữa 2 primer không nên quá lớn, phản ứng PCR thường tối ưu với những đoạn trình tự nhỏ hơn 1kb (Phan Cự Nhân, 2001).
2.8.2.5 Taq – polymerase
Là một DNA polymerase chịu nhiệt, được tách chiết từ một vi khuẩn suối nước nóng có tên là Thermus aquaticus. Taq - polymerase không bị phá hủy ở nhiệt
độ biến tính của phản ứng PCR và hoạt động tối ưu ở 68 – 72oC .
Nồng độ enzyme Taq polymerase được sử dụng thông thường là 0.5 – 5 đơn vị trên 100µl dung dịch phản ứng. Nếu nồng độ Taq quá cao có thể tạo ra những sản phẩm không chuyên biệt làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ Taq quá thấp, phản ứng sẽ không có đủ lượng enzyme cần thiết để tạo ra sản phẩm PCR theo mong muốn (Bùi Chí Bửu, 1999).
2.8.2.6 Số lượng chu kỳ trong phản ứng PCR
Số chu kỳ cho 1 phản ứng tùy thuộc vào số lượng bản sao ban đầu của mẫu. Ví dụ nếu lượng bản mẫu ban đầu là 105 thì cần 25 – 30 chu kỳ, nếu lượng bản mẫu là 102 – 103 thì số lượng chu kỳ là 35 – 40 .
Trong thực tế không nên thiết lập số chu kỳ quá lớn cho 1 phản ứng PCR. Sở
dĩ như vậy là vì phản ứng PCR diễn tiến qua 2 giai đoạn, ở giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân của lượng mẫu, sau đó hiệu quả khuyếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau:
- Sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng - Sự xuất hiện các sản phẩm phụức chế phản ứng
- Các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau (Phan Cự Nhân, 2001).