Mẫu nghiên cứu gồm chồi giống thương phẩm và các mẫu lá bệnh được lấy ngẫu nhiên từ 3 giống dứa Cayenne:
- Giống Thái Lan và giống Lâm Đồng do nông trường Phạm Văn Hai cung cấp. - Giống Trung Quốc do nông trường Thọ Vực cung cấp.
Hình 3.1: Mẫu chồi giống dứa Cayenne thương phẩm
3.1.2 Dụng cụ và thiết bị
- Máy ly tâm Mikro 22R - Máy vortex
- Máy luân nhiệt iCycle (BioRad) - Bộ nguồn và bồn điện di (BioRad) - Bình đựng Nitơ lỏng
3.1.3 Hóa chất
3.1.3.1 Hóa chất dùng cho tách chiết RNA
Sử dụng kit ly trích AurumTM Total RNA Mini Kit (Catalog #732-6820) do Bio Rad cung cấp:
- Lysis solution.
- Low stringency wash solution (X5). - High stringency wash solution.
- DNase I (ở dạng bột rắn, cần pha buffer trước khi sử dụng). - DNase dilution solution.
- Elution solution.
Ngoài ra, còn có các hóa chất khác cần cung cấp riêng: - β- mercaptoethanol, 14.2 M. - Polyvinylpyrolidone - 40 (PVP), 2%. - Ethanol 100% và 70%. - Tris-base (pH 7.5, 10 mM). - Nitơ lỏng. - NaOH 0.1M. - EDTA 1mM.
- DEPC (Diethyl pyrocarbonate).
3.1.3.2 Hóa chất dùng cho phản ứng RT-PCR
- Primer cho phản ứng RT-PCR:
Primer 225: 5'-ACAGGAAGGACAACACTCAC-3' Primer 226: 5'-CGCACAAACTTCAAGCAATC-3'
(Theo thiết kế của Sether D.M và ctv, 2001)
Cặp primer này sẽ khuếch đại từ vị trí nucleotide thứ 118 đến nucleotide 707 trên gene mã hóa cho HSP 70 của PMWaV-1 cho ra sản phẩm có kích thước 589bp.
118 707 Đoạn khuếch đại 589bp Gene mã hóa HSP70 Primer 226 Primer 225 5’ 3’ Hình 3.2: Sơđồ phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn gene HSP 70 của PMWaV-1 bằng cặp primer 225, 226.
Các hóa chất khác thuộc bộ kit Access RT-PCR System (Promega) gồm: - AMV / Tfl Buffer (5X)
- dNTP (10mM) - MgSO4 (25 mM)
- Enzyme reverse transcriptase AMV (5 Unit/µl) - Enzyme Taq polymerase Tfl (5 Unit/µl)
3.1.3.3 Hóa chất dùng cho điện di DNA - Agarose (BioRad). - Agarose (BioRad).
- Ethidium bromide.
- Loading dye 6X (Promega). - Nước cất 2 lần.
- Dung dịch TAE 1X (Tris acetat 40mM, EDTA 0,1mM, pH 8). - Thang DNA (100bp DNA ladder – Promega).
Hình 3.3: Thang DNA
3.1.3.4 Hóa chất dùng cho điện di RNA
- MOPS buffer 5X (MOPS 10 mM, sodium acetat 2,5 mM, EDTA 0,5 mM, pH 7,0).
- Formaldehyde 37%. - Formamide.
- Nước cất khử ion, khử RNase.
- Dung dịch đặt mẫu biến tính (loading dye biến tính).
3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Tách chiết RNA
Mẫu chồi dứa được lột hết các lá ngoài, lấy phần lõi trắng bên trong cắt thành từng mảnh nhỏ (<5mm), nghiền thành bột mịn trong Nitơ lỏng rồi đem ly trích RNA với bộ kit Aurum Total RNA Mini Kit theo các bước:
1. Cho 60 mg mẫu vào tube ly tâm 2 ml có nắp đậy. Hòa tan mẫu bằngvới 700 µl dung dịch ly giải (lysis solution).
2. Ly tâm dịch ly giải ở 14 000 vòng trong 3 phút, chuyển dịch nổi vào tube ly tâm 2 ml mới.
1500 bp
1000 bp
500 bp
3. Thêm 700 µl ethanol 70% vào mỗi tube, hòa tan bằng pipet cho đến khi dung dịch không còn phân lớp.
4. Ủ ấm dịch hòa tan trong water bath 700C (chuẩn bị cho bước 12). Đặt RNA binding column vào tube ly tâm 2 ml không nắp.
5. Cho 700 µl dung dịch ở bước 3 vào RNA binding column, ly tâm 60 giây, loại bỏ dịch lọc. Thực hiện tương tự cho hết phần dịch còn lại.
6. Cho 700 µl dịch rửa low stringency vào RNA binding column, ly tâm 30 giây, loại bỏ dịch lọc.
7. Trộn 5 µl DNase với 75 µl dung dịch DNase delution (trong tube 1.5 ml), cho vào RNA binding column. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, ly tâm 30 giây, loại bỏ dịch lọc.
8. Cho 700 µl dung dịch high stringency vào RNA binding column, ly tâm 30 giây, loại bỏ dịch lọc
9. Thực hiện tương tự bước 12 với dung dịch low stringency 10. Ly tâm thêm 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dịch rửa.
11. Chuyển RNA binding column vào tube 1.5 ml có nắp đậy, cho 80 µl dịch hòa tan (elution solution) đã ủ ở 70oC ở bước 5 vào, ủ 1 phút, ly tâm 2 phút để thu RNA tổng số. Dung dịch RNA được bảo quản ở 40C.
3.2.2 Điện di sản phẩm ly trích RNA
Nấu 16 ml gel 1,8%, chờ nguội đến khoảng 65oC, cho thêm 4 ml MOPS 5X và 400 µl formaldehyde. Khi gel nguội, ngâm trong dung dịch MOPS 1X khoảng 30 phút trước khi điện di.
Mẫu sản phẩm RNA trước khi điện di được làm biến tính ở 65oC trong 30 phút rồi làm lạnh nhanh trong nước đá khoảng 1 phút. Sau đó, trộn với dung dịch nạp mẫu biến tính rồi đem điện di ở 30V trong 150 phút.
3.2.3 Xây dựng quy trình RT-PCR
3.2.3.1 Kiểm tra độđặc hiệu của primer
Trước khi được dùng làm mồi đặc hiệu cho phản ứng RT-PCR phát hiện
PMWaV-1, cặp primer 225, 226 được kiểm tra các cấu trúc thứ cấp bằng phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer của hãng IDT (http://www.scitools.idtdna.com/scitools/Applications/OligoAnalyzer/) và được kiểm tra độ đặc hiệu cho PMWaV-1 bằng công cụ BLAST của NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
3.2.3.2 Xác định chu trình nhiệt tối ưu
Quy trình RT-PCR được thực hiện theo theo kiểu one step. Primer 226 sẽ
thực hiện phản ứng reverse với tác động của enzyme reverse transcriptase, tổng hợp sợi cDNA từ RNA của PMWaV-1. Sau đó dưới tác động của Taq – polymerase, cả
hai primer 225 và 226 sẽ hoạt động, khuếch đại các cDNA vừa tạo. Với nguyên tắc trên, phản ứng RT-PCR tối ưu sẽđược khảo sát dựa trên 5 chu trình sau
Bảng 3.1: Các chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR được khảo sát
Chu trình nhiệt Giai đoạn 1 2 3 4 5 Tạo cDNA 45oC/45’ 94oC/2’ 45oC/45’ 94oC/2’ 45oC/45’ 94oC/2’ 45oC/45’ 94oC/2’ 45oC/45’ 94oC/2’ Khuếch đại cDNA 92oC/30’’ 52oC/1’ 68oC/1’30’’ (45 chu kỳ) 92oC/30’’ 54oC/1’ 68oC/1’30’’ (45 chu kỳ) 92oC/30’’ 56oC/1’ 68oC/1’30’’ (45 chu kỳ) 92oC/30’’ 58oC/1’ 68oC/1’30’’ (45 chu kỳ) 92oC/30’’ 58oC/1’ 68oC/1’30’’ (10 chu kỳ) 92oC/30’’ 54oC/1’ 68oC/1’30’’ (35 chu kỳ) Kéo dài 68oC/8’ 68oC/8’ 68oC/8’ 68oC/8’ 68oC/8’
Trong đó chu trình 2 được thực hiện theo Sether (2001), các chu trình 1, 3, 4 chỉ thay đổi nhiệt độ bắt cặp ở giai đoạn khuếch đại cDNA của chu trình 2.
3.2.3.3 Xác định nồng độ primer thích hợp
Hỗn hợp hóa chất cần thiết cho một sản phẩm PCR (50 µl) được pha như sau:
Hóa chất Thể tích Nồng độ cuối
AMV / Tfl Buffer (5X) 10 µl 1X
dNTP (10mM) 1 µl 0.2 mM
MgSO4 (25 mM) 2 µl 1 mM
Enzyme reverse AMV (5 Unit/µl) 1 µl 0.1 Unit/µl Enzyme Taq polymerase Tfl (5 Unit/µl) 1 µl 0.1 Unit/µl
Primer 225 (25 mM) --- ---
Primer 226 (25 mM) --- ---
RNA khuôn mẫu 2 µl
Nước cất 2 lần 29 µl
Trong đó, nồng độ primer cho phản ứng được khảo sát ở 3 mức nồng độ cuối là 1 mM, 0,8 mM và 0,6 mM.
3.2.3.4 Xác định số chu kỳ phản ứng tối ưu.
Phản ứng RT-PCR được thực hiện ở 5 mức 41, 42, 43, 44, 45 chu kỳ để xác
định số chu kỳ cho hiệu quả khuếch đại tối ưu.
3.3.4 Điện di sản phẩm RT-PCR
Sản phẩm PCR được đem điện di trên gel agarose 1.5% với hiệu điện thế 50V trong 90 phút. Quan sát kết quả điện di dưới đèn cực tím. Kích thước các sản phẩm PCR được ghi nhận thông qua sự so sánh với thang chuẩn 100 bp DNA ladder (Promega). Những mẫu khuếch đại có chứa band với kích thước 600 bp, tương
đương với đoạn 589 bp trên lý thuyết, sẽ là những mẫu dương tính - bị nhiễm PMWaV-1.
3.3.5 Giải trình tự sản phẩm RT-PCR
Để kiểm tra độđặc hiệu của sản phẩm RT-PCR, có 2 mẫu sản phẩm RT-PCR dương tính trên điện di, 1 của cây bệnh, 1 của chồi dứa thương phẩm (không có triệu chứng bệnh) được đem giải trình tự. Do hạn hẹp về thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi không thể trực tiếp tiến hành giải trình tự nên gửi mẫu sản phẩm RT-PCR sang công ty Macrogene – Hàn Quốc để thực hiện. Sau đó, trình tự sẽ được so sánh với dữ liệu của đoạn gene mã hóa cho HSP 70 của PMWaV-1 trên GenBank bằng các phần mềm Clustal X 1.83 và BLAST.
3.3.6 Giám định chồi giống dứa
Áp dụng quy trình đã xây dựng được, tiến hành giám định trên 3 giống dứa Thái Lan, Trung Quốc, Lâm Đồng, mỗi giống gồm 30 mẫu chồi giống dứa thương phẩm được lấy ngẫu nhiên từ các nông trường. Tất cả được thực hiện phản ứng RT-PCR và điện di.
Phần 4 KẾT QUẢ – THẢO LUẬN
4.1 Kết quả ly trích RNA
Sau khi tiến hành ly trích RNA tổng số của mẫu dứa, sản phẩm ly trích được
điện di trong MOPS buffer 1X để kiểm chứng xem có thu được RNA hay không. Kết quả kiểm tra sản phẩm RNA sau ly trích được thể hiện qua hình sau:
Hình 4.1: Kết quảđiện di sản phẩm ly trích RNA
Chú thích: Giếng 1: Mẫu RNA không biến tính Giếng 2: Mẫu RNA biến tính
Khi ly trích RNA thực vật, sản phẩm chiếm đại đa số là 2 tiểu phần ribosome 18S và 28S. Các loại RNA khác như mRNA, RNA virus có rất ít nên khi điện di, hầu như không thể thấy được các sản phẩm này, chỉ có thể thấy được 2 vạch 28S và 18S. Vì vậy, 2 vạch sản phẩm 28S, 18S được xem như là dấu hiệu nhận biết của RNA thực vật. Hình 4.1 cho thấy sản phẩm RNA ly trích được có chứa 2 vạch tương
ứng với các ribosome 28S và 18S. Trong đó, ở giếng 2, mẫu RNA được làm biến tính với nhiệt trước khi điện di nên các sợi RNA duỗi ra và di chuyển trong gel chậm hơn giếng 1. Như vậy, kết quả trên cho thấy đã ly trích được RNA tổng số từ mẫu dứa.
28 S
18 S 1 2
4.2 Kết quả xây dựng quy trình RT-PCR
4.2.1 Kết quả khảo sát độđặc hiệu của primer
Cặp primer 225, 226 được chúng tôi khảo sát các đặc tính cơ bản và các cấu trúc thứ cấp bằng phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer (http://www.scitools.idtdna.com/scitools/Applications/OligoAnalyzer/). Việc khảo sát các đặc tính cơ bản của cặp primer cho kết quả như sau
Bảng 4.1: Các đặc tính cơ bản của cặp primer 225, 226 Primer 225 Primer 226 Trình tự Số Nu % GC Tm 5'-ACAGGAAGGACAACACTCAC-3' 20 50 % 57,3oC 5'-CGCACAAACTTCAAGCAATC-3' 20 45 % 55,7oC
Các thông số này của cặp primer 225, 226 hoàn toàn phù hợp với các yêu cầu cơ bản để một cặp primer hoạt động hiệu quả trong phản ứng RT-PCR như: nhiệt độ
bắt cặp của 2 primer không cách xa nhau, số Nu tối ưu trong khoảng 10 - 25 Nu, và % GC mỗi primer ở 20 - 80 %.
Tiếp theo là việc khảo sát khả năng hình thành các cấu trúc thứ cấp của primer, một yếu tố có ảnh hưởng lớn đến kết quả của phản ứng RT-PCR. Các cấu trúc này bao gồm cấu trúc kẹp tóc (hairpin loop – hình thành từ sự bắt cặp giữa các base trong cùng một primer), homo dimer (hai primer giống nhau tự bắt cặp), hetero dimer (primer xuôi bắt cặp với primer ngược). Nếu primer có các cấu trúc thứ cấp này bền vững thì primer sẽ kém hoạt động, hiệu quả của phản ứng PCR sẽ giảm
đáng kể.
Để xác định độ bền vững của các cấu trúc thứ cấp, người ta sử dụng chỉ số
năng lượng tự do (Delta G, kcal/mole). Theo hãng IDT, các cấu trúc thứ cấp có năng lượng tự do lớn hơn -9 kcal/mole sẽ hầu như không ảnh hưởng đến hoạt động của phản ứng PCR, còn các cấu trúc có năng lượng tự do nhỏ hơn -9 kcal/mole đòi hỏi phải cung cấp một nhiệt độ khá cao mới có thể phá vỡ chúng.
Kết quả khảo sát các cấu trúc thứ cấp của cặp primer 225, 226 cho thấy: - Primer 225 có 1 cấu trúc kẹp tóc, 4 cấu trúc homo dimer.
- Primer 226 có 1 cấu trúc kẹp tóc, 8 cấu trúc homo dimer. - Hai primer có 7 cấu trúc hetero dimer (Phụ lục 1)
Trong đó, các cấu trúc có năng lượng tự do Delta G thấp nhất là:
Bảng 4.2: Các cấu trúc thứ cấp mang năng lượng tự do thấp nhất Cấu trúc thứ cấp Delta G (kcal/mol) Kẹp tóc Homo dimer (Primer 225) Homo dimer (Primer 226) Hetero dimer 5' CGCACAAA || ::C 3' CTAACGAACTT 5' ACAGGAAGGACAACACTCAC || : : :: 3' CACTCACAACAGGAAGGACA 5' CGCACAAACTTCAAGCAATC ||| ::: 3' CTAACGAACTTCAAACACGC 5' ACAGGAAGGACAACACTCAC : |||| 3' CTAACGAACTTCAAACACGC - 0,21 - 1,6 - 3,54 - 5,12 Tất cả các cấu trúc thứ cấp kể trên đều có năng lượng tự do lớn hơn -9 kcal/mole nên sẽ không gây ảnh hưởng gì đáng kể đến hoạt động của cặp primer
225, 226 trong phản ứng RT-PCR.
Sau đó, cặp primer 225, 226 được kiểm tra độ đặc hiệu cho PMWaV-1 bằng công cụ BLAST của NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Chương trình này dò tìm trên cơ sở dữ liệu của các ngân hàng gene để tìm ra tất cả các gene có trình tự tương đồng với cặp primer này. Kết quả BLAST cho thấy có 3 đoạn gene có vị trí tương đồng với cặp primer 225, 226
Bảng 4.3: Kết quả phân tích BLAST của 2 primer 225, 226
Số Nu tương đồng
STT Tên trình tự
Primer 225 Primer 226 1 gi|18253957|gb|AF414119.1|AF414119 Pineapple
mealybug wilt associated virus-1, complete cds
20/20 20/20
2 gi|22227|emb|X63205.1|ZMCAB48 Zea mays cab48 gene for chlorophyll a/b binding protein precurso
18/20 ---
3 gi|62630081|gb|AC122311.6| Mus musculus BAC clone RP23-298B23 from chromosome 6, complete sequence
--- 18/20
Chú thích: --- : không có vị trí tương đồng.
Trong đó, hai trình tự 2 và 3 chỉ có vị trí tương đồng với 1 trong 2 primer, chỉ
duy nhất trình tự 1, PMWaV-1, là có 2 vị trí tương đồng hoàn toàn với cặp primer 225, 226 nằm trên đoạn gene mã hóa cho HSP 70 (Phụ lục 2).
Như vậy, về mặt lý thuyết, cặp primer 225, 226 hoàn toàn đặc hiệu và phù hợp cho phản ứng RT-PCR phát hiện PMWaV-1.
4.2.2 Kết quả xác định chu trình nhiệt tối ưu
Ở bước đầu thực hiện phản ứng RT-PCR, chúng tôi đã thực hiện quy trình RT-PCR theo Sether và cộng sự, (2001) (chu trình 2). Tuy nhiên, trong quá trình thí nghiệm, có lẽ do không phù hợp với hóa chất của bộ kit Access RT-PCR System (Promega) mà chúng tôi sử dụng nên quy trình này cho hiệu quả khuếch đại không như mong đợi. Vì vậy, chúng tôi khảo sát lại trên 5 quy trình RT-PCR như đã trình bày ở phần phương pháp thực hiện. 5 chu trình trên được khảo sát với cùng 1 mẫu RNA ly trích từ cây bệnh và cho kết quả sau:
Hình 4.2: Sản phẩm RT-PCR của 5 chu trình nhiệt
Chú thích: L: ladder
Giếng 1, 2, 3, 4, 5: lần lượt là sản phẩm RT-PCR của các chu trình nhiệt 1, 2, 3, 4, 5.
Kết quả trên cho thấy chu trình nhiệt của Sether (chu trình 2) đã khuếch đại
được đoạn gene mong muốn 589 bp. Tuy nhiên, hiệu quả khuếch đại của chu trình này không cao, phản ứng chủ yếu xảy ra sự bắt cặp không chuyên biệt nên kết quả điện di cho thấy cường độ sáng của vạch sản phẩm phụ rất lớn, trong khi vạch sản phẩm chính lại khá mờ.
Sự thay đổi nhiệt độ bắt cặp của chu trình 2 cũng không cho kết quả tốt hơn.
Ở chu trình 1, nhiệt độ bắt cặp quá thấp nên không xảy ra sự bắt cặp chuyên biệt, phản ứng chỉ tạo sản phẩm phụ. Ở chu trình 3, nhiệt độ bắt cặp cao hơn giúp ít xảy ra sự bắt cặp không chuyên biệt nên lượng sản phẩm phụ ít đi. Tuy nhiên, với nhiệt
độ này, phản ứng RT-PCR xảy ra khó khăn hơn và tạo ra lượng sản phẩm chính ít hơn chu trình 2. Với chu trình 4, nhiệt độ bắt cặp 58oC là quá cao cho cặp primer 225, 226 nên sự khuếch đại chuyên biệt hầu như không xảy ra.
589 bp
L 1 2 5 3 4
500 bp 1.500 bp
Trong 5 chu trình, chu trình 5 cho sự khuếch đại đặc hiệu cao nhất, vạch sản phẩm phụ mờ, còn vạch sản phẩm chính rất sáng và rõ nét. Chu trình này được xây