Để xác định trình tự của một đoạn DNA mong muốn, phương pháp Sanger là phương pháp thường được sử dụng nhất hiện nay. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: thực hiện sự tổng hợp sợi DNA bổ sung với sợi cần xác định trình tự (thực hiện phản ứng PCR), nhưng ngoài 4 loại dNTP thông thường còn bổ sung thêm các dideoxynucleotide triphosphate (ddNTP). Các ddNTP này không có nhóm -OH ở đầu 3' nên khi chúng gia nhập vào chuỗi sẽ làm cho sự kéo dài chuỗi bị dừng lại (do không thể tạo được liên kết giữa nhóm -OH 3' của nucleotide trước với nhóm phosphate 5' của nucleotide sau).
Sự gia nhập của các ddNTP vào chuỗi là hoàn toàn ngẫu nhiên nên phản ứng kéo dài sẽ ngừng lại ở một vị trí bất kỳ. Do đó, nếu cung cấp một lượng DNA mẫu
đủ lớn thì các phản ứng tổng hợp sẽ cho hàng loạt các sản phẩm có độ dài tăng dần: 1, 2, 3, 4… nucleotide. Như vậy, chỉ cần biết được ở mỗi đoạn kết thúc bằng loại ddNTP nào thì sẽ có thể tìm ra được trình tự của đoạn DNA mong muốn. Để làm
được điều đó, người ta thực hiện 4 phản ứng PCR cho mẫu DNA muốn giải trình tự
cùng lúc, ở mỗi phản ứng chỉ cho thêm một loại ddNTP (A, T, G hoặc C). Sau phản
ứng, kết quả điện di sản phẩm của cả 4 trên cùng một gel acrylamide sẽ giúp xác
định được trình tự của đoạn DNA (Bùi Trang Việt, 2002).
Hiện nay, với các thế hệ máy đọc trình tự mới, các ddNTP được gắn thêm các chất phát màu huỳnh quang, mỗi loại ddNTP gắn với 1 màu khác nhau thay vì gắn với đồng vị phóng xạ như phương pháp kinh điển. Kết thúc phản ứng, các đoạn DNA sẽ được phân tích bằng phương pháp điện di mao quản (capillary electrophoresis). Cuối cùng, từ kết quả điện di, máy sẽ đọc các màu huỳnh quang phát ra trên capillary và phân tích với các phần mềm chuyên dụng để cho ra trình tự
Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Vật liệu nghiên cứu 3.1.1 Mẫu