3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Khóa luận tốt nghiệp này đƣợc thực hiện từ 19/3/2007 đến 8/2007 tại phòng Bảo vệ thực vật, khoa Nông học, trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh và viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Công nghệ môi trƣờng – phòng Công nghệ sinh học thực vật, trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
3.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu
Là 11 dòng Trichoderma phân lập từ các vùng sinh thái, địa lý khác nhau ở Việt Nam, đã đƣợc định danh bằng hình thái và xác định tính đối kháng với các nấm gây bệnh hại cây trồng bởi TS. Lê Đình Đôn và cs, tại bộ môn Bảo vệ Thực vật, khoa Nông học, trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, dựa theo khóa phân loại Trichoderma của Gary J. Samuels (2004) và tiêu bản chuẩn.
Bảng 3. 1 Các dòng nấm sử dụng để định danh và phân nhóm trong đề tài
Ký hiệu
Tên loài định danh dựa vào
hình thái
Địa điểm phân lập (Quận-Huyện, Tỉnh- Thành phố (đối tƣợng lấy mẫu)) Tính đối kháng với các nấm gây bệnh cây trồng T38 T. virens Quận Thủ Đức, Tp.HCM (đất) Sclerotium rolfsii (+++)* Pythium spp. (+++) Phytophthora spp. (+)*
T14 T. harzianum Huyện Đa Oai, Lâm Đồng (sầu riêng)
Rhizoctonia solani (+++)
Pythium spp. (+++)
Pythium spp. (+)
Phytophthora spp. (++)*
T6 Chƣa xác định Tiền Giang (dứa)
Pythium spp.(++)
Phytophthora spp. (++)
T37 T. sinensis Đồng Nai (sầu riêng) Rhizoctonia solani (+++)
Phytophthora capsici (+++) T33 T. asperellum Kiên Giang (dứa) Rhizoctonia solani (+++)
Phytophthora capsici (+++) T19 T. asperellum Tây Ninh (đậu phụng) Chƣa xác định
T2 T. asperellum hoặc
T. harzianum Lâm Đồng (trà) Chƣa xác định T42 T. viride Bình Phƣớc (dứa) Chƣa xác định
T88 T. asperellum Đồng Nai (đất) Fusarium spp. (+++) Phytophthora spp.(+++) Sclerotium rolfsii (+++) T85 T. harzianum Nghệ An (đất rừng) Fusarium spp. (+) T68 T. atroviride Bình Phƣớc (đất rừng) Sclerotium rolfsii (+++) Rhizoctonia solani (+++) Fusarium spp. (+)
(*): (+++) đối kháng mạnh, (++) đối kháng trung bình, (+) đối kháng yếu.
3.2. Hoá chất
Môi trƣờng CAM để lƣu trữ nguồn Trichoderma: thành phần gồm bột bắp (30 g), đƣờng dextrose (20 g), agar (15 – 20 g) và nƣớc cất vừa đủ 1 lít.
Môi trƣờng PGA (Potato Glusose Agar) để phục hồi Trichoderma: thành phần gồm khoai tây (200 g), glucose (20 g), agar (15 – 20 g) và nƣớc cất vừa đủ 1 lít.
Môi trƣờng nhân sinh khối Trichoderma: thành phần gồm yeast extract (5 g), KH2PO4 (0.5 g), K2HPO4 (0.5 g), MgSO4 (0.5 g), glucose (20 g), CaCl2 (rất ít) và nƣớc cất vừa đủ 1 lít.
Ly trích DNA tổng số Trichoderma: nitơ lỏng, lysis buffer, phenol/ chloroform/ isoamyl alcohol (25: 24: 1), chloroform/ isoamyl alcohol (24: 1), isopropanol, ethanol 70 %, dung dịch TE 1X
để pha gel và làm buffer chạy điện di), ethidium bromide (nồng độ 5.10-3 % theo thể tích) và blue loading dye 6X (Promega)
Hoá chất cho phản ứng PCR (Promega): Taq DNA polymerase, 10X PCR buffer, dNTP, MgCl2, forward primer và reverse primer.
3.3. Dụng cụ và thiết bị
Bình tam giác (250 ml, 500 ml (Đức)), giấy nhôm, nồi nấp khử trùng Tommy (Mỹ), máy lắc định ôn, máy vortex (IKA Works), ống nghiệm dung tích 15 ml (Đức), bộ cối chày nghiền mẫu (Đức), micropipette (10 l, 100 l, 1000 l (Đức)), tủ lạnh (-70 0
C, -20 0C, - 4 0C (Sanyo – Nhật)), máy cất nƣớc 2 lần, máy chụp gel (Biorad – Mỹ), cối sứ và chày giã (Đức), eppendorf (0.2 ml, 05 ml, 1.5 ml (Mỹ), cân phân tích 4 số (Ohaus – Mỹ), máy hút và tủ cấy vô trùng (Anh Quốc), pipet các loại (Nichiryo – Nhật), máy ly tâm lạnh (Hettich – Đức), bồn ủ nhiệt (Memmert), máy điện di (Cosmo Bio Co. – Nhật) và lò viba (Electrolux – Thụy Điển)
3.4. Phục hồi các dòng Trichoderma:từ những ống nghiệm lƣu trữ nguồn.
Cách pha 1 lít môi trƣờng PGA: 200 g khoai tây đƣợc gọt vỏ cắt nhỏ và đun sôi, lọc qua vải để chỉ lấy phần dịch nƣớc. Thêm vào đó lƣợng glucose, agarose nhƣ trên và lƣợng nƣớc cho vừa đủ 1 lít. Đun hỗn hợp trên cho đến khi agarose và glucose tan ra đều. Môi trƣờng PGA đƣợc cho vào bình tam giác và hấp khử trùng ở 121 0C trong 20 phút bằng autoclave. Để môi trƣờng nguội bớt rồi đổ khoảng 15 ml môi trƣờng vào đĩa petri sạch (90 mm), để nguội môi trƣờng sẽ đông cứng lại.
Dùng que cấy lấy những bào tử từ ống lƣu trữ nguồn Trichoderma, đặt lên giữa mặt thạch PGA trong đĩa petri. Sau 2 – 3 ngày các khuẩn ty Trichoderma sẽ mọc bên trên bề mặt đĩa.
3.5. Nhân và thu sinh khối Trichoderma
Nhân sinh khối Trichoderma: trong môi trƣờng nhân sinh khối nấm lỏng lắc. Chuẩn bị môi trƣờng: Tất cả các thành phần môi trƣờng đƣợc cho vào một với lƣợng nƣớc cất vừa đủ dung lƣợng cần thiết, khuấy đều. Cho vào mỗi bình tam giác 100 ml môi trƣờng. Hấp khử trùng trong 20 phút ở 121 0C. Để nguội.
những bình tam giác trên. Rồi đem lắc với cƣờng độ 150 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng, để sợi nấm tiếp xúc tối đa với môi trƣờng vì thế sợi nấm luôn ở trạng thái sinh trƣởng mạnh nên không mọc bào tử. Lắc liên tục cho đến khi sợi nấm mọc nhiều và đều khắp môi trƣờng (khoảng 2 – 3 ngày), dừng lại và thu lấy sợi nấm.
Cách thu lấy sợi nấm: Dùng vải và phễu lọc đã hấp khử trùng và sấy khô để lọc thu lấy phần sợi nấm, vắt kiệt nƣớc rồi bỏ vào giấy bạc, cán mỏng để khi nghiền trong nitơ lỏng đƣợc dễ dàng, bảo quản ở -70 0
C.
3.6. Ly trích DNA tổng số Trichoderma
Tham khảo tài liệu của Sambrook và cs (1989), chúng tôi ly trích DNA nấm
Trichoderma theo phƣơng pháp Lysis buffer có cải tiến cho phù hợp điều kiện nghiên cứu. Lƣợng mẫu cần ly trích chiếm 1/ 3 thể tích mỗi ống nghiệm.
Bƣớc 1: Nghiền sinh khối Trichoderma trong nitơ lỏng đến khi mịn, cho vào các ống nghiệm (thể tích 15 ml).
Bƣớc 2: Thêm vào 3 ml lysis buffer. Trộn đều, ủ ấm ở 65 0C trong vòng 1 – 2 giờ. Bƣớc 3: Tiếp tục thêm vào 1 ml phenol/ chloroform/ isoamylalcohol (25: 24: 1). Nhẹ nhàn lắc đều. Ly tâm 10 phút với tốc độ 4000 vòng/ phút ở 10 0C. Hút lấy phần dịch nổi ở trên (2 – 3 ml), cho vào ống nghiệm có dung tích 15 ml khác.
Bƣớc 4: Thêm vào 1 ml chloroform/ isoamylalcohol (24: 1). Trộn đều, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/ phút trong 10 phút ở 10 0C. Hút lấy phần dịch nổi ở trên (2 – 3 ml), cho vào ống nghiệm có dung tích 15 ml khác.
Bƣớc 5: Thêm vào một lƣợng isopropanol tỉ lệ khoảng 0.6 tổng thể tích của ống nghiệm. Đảo đều, nhẹ, để qua đêm ở -20 0C (hoặc để nhiệt độ phòng 5 – 10 phút). Bƣớc 6: Dùng que thu DNA tủa thành cụm ở đáy ống
Bƣớc 7: Rửa tủa DNA trong ethanol 70 %, lập lại 3 – 4 lần.
Bƣớc 8: Phơi tủa DNA thật khô (trong 2 – 3 giờ). Pha loãng bằng 1 ml TE 1X.
3.7. Kiểm tra kết quả ly trích và pha loãng DNA
Để kiểm tra kết quả ly trích có thu đƣợc DNA tổng số hay không và DNA pha loãng có nồng độ thích hợp để thực hiện phản ứng PCR hay chƣa, chúng tôi tiến hành điện di sản phẩm ly trích và pha loãng trên gel agarose 1%.
Bƣớc 1: Chuẩn bị gel agarose 1 %, cân 0.25 g agarose cho vào 25 ml TAE 0.5X, lắc nhẹ cho agarose phân tán đều, đun nóng trong lò viba ở 650 W trong 2 phút. Để chai nguội lại khoảng 50 – 60 0C, đổ vào khuôn thật bằng phẳng có gắn lƣợc 12 – 18 giếng. Chờ gel đông (khoảng 15 phút), lấy lƣợc ra và bắt đầu tiến hành nạp mẫu.
Bƣớc 2: Nạp mẫu, xác định các thông số điện di và đọc kết quả
Đối với DNA tổng số:Dùng micropipette hút lấy 2 l mẫu, trộn đều với 2 l blue loading dye buffer 6X, hút tổng lƣợng thể tích là 4 l bơm vào 1 giếng trên gel agarose 1 %. Làm tƣơng tự với các mẫu khác. Tiến hành điện di bảng gel đó trong dung dịch đệm TAE 0.5 X, hiệu điện thế 110 V, cƣờng độ dòng điện 400 A trong 20 phút. Sau đó, bảng gel đƣợc chuyển vào thuốc nhuộm ethidium bromide (1%) trong khoảng 15 phút, rửa sạch và chụp gel bằng tia tử ngoại (UV) của máy Gel doc 2000 (Biorad) và kết quả đƣợc đọc bằng phần mềm Quality One.
Nếu sản phẩm ly trích có DNA tổng số thì trên gel điện di sẽ có band DNA phát sáng dƣới dạng vạch. Mức độ tập trung và độ đậm nhạt của băng điện di phản ánh độ tinh sạch và nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA. Từ đó, kết hợp với những hiểu biết về phƣơng pháp định lƣợng nồng độ DNA bằng phân tử Mass (mục 2.8.3, phần 2 tổng quan tài liệu), chúng tôi có thể ƣớc lƣợng nồng độ DNA ly trích đƣợc và dự đoán đƣợc độ pha loãng.
Đối với DNA pha loãng: Mỗi mẫu lấy 4 l trộn với 2 l loading buffer 6X, thao tác tiến hành tƣơng tự nhƣ trên. Kết quả thu đƣợc cho phép ta xác định đƣợc nồng độ cần thiết để chọn lấy và thực hiện phản ứng PCR.
3.8. Phản ứng PCR
DNA làm khuôn: thu nhận qua quá trình ly trích DNA bộ gen của nấm
Trichoderma, sau đó pha loãng đến nồng độ DNA thích hợp cho phản ứng PCR khoảng 15 – 20 ng/ µl.
Primer: PCR khuếch đại vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 với primer ITS4 và ITS5 (White và cs, 1990) và dựa vào sơ đồ, cấu trúc primer trên toàn vùng tef1 do Chaverri, P. và cs thiết lập năm 2003, chúng tôi chọn cặp primer EF1 – 728F và EF1 – 986R (Carbone và Kohn, 1999) để khuếch đại một phần của vùng tef1.
Bảng 3. 2 Các primer dùng trong đề tài và trình tự của chúng
Primer Trình tự primer theo chiều 5’- 3’
ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC
ITS5 GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G
EF1 – 728F CAT CGA GAA GTT CGA GAA GG
EF1 – 986R TAC TTG AAG GAA CCC TTA CC
Hình 3. 1 Sơ đồ phân vùng và vị trí primer trên vùng từ 18S đến 28S – rDNA và vị trí vùng khuếch đại (vùng đánh dấu ellip) với cặp primer ITS4 và ITS5
Hình 3. 2 Sơ đồ các primer trên toàn vùng tef1 và vị trí vùng khuếch đại (vùng đánh dấu ellip) với cặp primer EF1 – 728F và EF1 – 986R
Các thành phần phản ứng PCR đƣợc phối trộn theo thứ tự đƣợc liệt kê ở bảng bên dƣới để đảm bảo hiệu quả cho phản ứng do Taq DNA polymerase khi trộn vào hỗn hợp phản ứng PCR sẽ hoạt động ngay.
Bảng 3. 3 Thành phần phản ứng PCR và liều lƣợng dùng cho một phản ứng Thành phần Thể tích sử dụng ( l) Nồng độ cuối Nƣớc cất 31.75 PCR buffer 10X 10.00 1.0X MgCl2 3.00 1.5 mM dNTP 0.50 0.2 mM Primer 1 1.50 10.0 pmol/ l Primer 2 1.50 10.0 pmol/ l Khuôn DNA 1.50 15.0 ng/ l
Taq DNA polymerase 0.25 5.0 U/ l
Tổng cộng 50.00
Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR: tham khảo, kết hợp và cải tiến quy trình của Wang C. Z. (2002), White và cs. (1990), Carbone và Kohn (1999) và VBI – CLF (2002) cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm.
Bảng 3. 4 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR
Cặp primer ITS4 và ITS5 Cặp primer EF1 – 728F và EF1 – 986R Chu kỳ Nhiệt độ (0
C) Thời gian Chu kỳ Nhiệt độ (0
C) Thời gian 1 95 3 phút 1 95 3 phút 2 – 31 95 1 phút 2 – 31 95 1 phút 58 45 giây 58 45 giây 72 1 phút 72 1 phút 31 72 10 phút 31 72 10 phút 3.9. Đánh giá kết quả PCR
Thực hiện tƣơng tự nhƣ phần đánh giá DNA pha loãng ở mục 3.7 (kiểm tra kết quả ly trích và pha loãng DNA). Các dòng nấm khác nhau đƣợc khuếch đại cùng
một cặp primer, trên band điện di không thể phân biệt đƣợc sự khác nhau giữa các dòng này, do đó cần phải giải trình tự sản phẩm PCR để phân tích.
3.10. Định danh tên loài 11 dòng Trichoderma
Sản phẩm PCR của vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng nấm
Trichoderma khảo sát đƣợc giải trình tự ở công ty Macrogen, Hàn Quốc. Trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma khảo sát đƣợc so sánh với dữ liệu của chúng trên NCBI. Dựa vào độ tƣơng đồng di truyền (%) kết hợp với kết quả định danh bằng hình thái, để từ đó xác định tên loài của 11 dòng
Trichoderma khảo sát. Dữ liệu trên NCBI đƣợc chúng tôi so sánh với nhau (bằng phần mềm Clustal X 1.83) trong phạm vi từng loài để chọn ra trình tự ổn định nhất (không có đột biến) và 1 – 2 trình tự đột biến phổ biến (không có đột biến điểm đơn lẻ). Việc làm này nhằm loại bỏ hiện tƣợng trình tự dòng khảo sát có tỉ lệ tƣơng đồng cao với trình tự đột biến của loài khác, sẽ làm nhiễu kết quả so sánh trình tự. Các loài đƣợc sử dụng cho so sánh dựa theo tiêu chí
Loài đƣợc định danh dựa vào hình thái.
Loài có đặc điểm gần giống về hình thái với loài định danh dựa vào hình thái.
Bảng 3. 5 Trình tự vùng ITS – rDNA của các dòng Trichoderma trên NCBI
Tên loài Mã số truy cập Địa điểm phân lập Thời gian công bố Tác giả T. asperellum
AY266673 Trung Quốc 01-04-2003 Zhang,C.L. và Xu,T.
AY380912 Mỹ 03-09-2003 Samuels,G.J. và cs
T. atroviride AY585878 Hungary 08-07-2004 Kredics,L. và cs
Z48818 Đức 29-03-1995 Kuhls,K.
T. hamatum
AJ507086 Úc 28-08-2002 Wuczkowski,M. và
Kubicek,C.P.
Z48816 Đức 29-03-1995 Kuhls,K.
AF362101 Hàn Quốc 19-03-2001 Park,D.S. và cs
T. koningii DQ313146 Canada 01-12-2005 Samuels,G.J. và cs
DQ313135 Brazil 01-12-2005 Samuels,G.J. và cs
T.
longibrachiatum
AY328038 Hungary 08-07-2004 Kredics,L. và cs
DQ297053 Mexico 15-11-2005 Sanchez,V. và cs
T. reesei X93938 Đức 04-12-1995 Kuhls,K. và cs
T. sinensis DQ083012 Đài Loan 01-06-2005 Samuels,G.J.
T. tomentosum AY154932 Iran 24-09-2002 Zafari,D.
DQ085432 Canada 03-06-2005 Samuels,G.J.
T. virens
AF057599 Hoa Kỳ 31-03-1998 Ospina,M.D. và cs
AF099008 Hoa Kỳ 16-10-1998 Samuels,G.J. và cs.
T. viride
DQ313155 New
Zealand 01-12-2005 Samuels,G.J. và cs
DQ315439 Anh 02-12-2005 Samuels,G.J. và cs
Bảng 3. 6 Trình tự vùng tef1 của các dòng Trichoderma trên NCBI
Tên loài Mã số truy cập Địa điểm phân lập Thời gian công bố Tác giả T. asperellum
AY376058 Hoa Kỳ 28-08-2003 Holmes,K.A. và cs
AY857274 Úc 13-12-2004 Druzhinina,I.S. và cs
T. atroviride AF348112 Hoa Kỳ 09-02-2001 Samuels,G.J. và cs
DQ307550 Sri Lanka 28-11-2005 Samuels,G.J.
T. harzianum
AF348101 Hoa Kỳ 09-02-2001 Samuels,G.J. và cs
AF348103 Hoa Kỳ 09-02-2001 Samuels,G.J. và cs
T. koningii DQ288997 Ecuador 14-11-2005 Samuels,G.J. và cs
T.
longibrachiatum
AY937412 Hoa Kỳ 17-02-2005 Samuels,G.J.
DQ297066 Mexico 15-11-2005 Sanchez,V. và cs
T.
saturnisporum AY937414 Nam Phi 14-09-2004 Samuels,G.J. T. sinensis AY750888 Đài Loan 14-09-2004 Samuels,G.J.
T. tomentosum AY750882 Canada 14-09-2004 Samuels,G.J.
Gliocladium
flavofuscum AY750891 Hoa Kỳ 14-09-2004 Samuels,G.J.
Hypocrea
virens AY750894
Cote
d'Ivoire 14-09-2004 Samuels,G.J.
T. viride
AF348116 Hoa Kỳ 09-02-2001 Samuels,G.J. và cs
DQ307555 CH. Czech 28-11-2005 Samuels,G.J. và cs
3.11. Phân nhóm xác đi ̣nh mối quan hê ̣ di truyền giữa 11 dòng Trichoderma
Với dữ liệu về trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng
Trichoderma. Chúng tôi tiến hành so sánh các trình tự này với nhau bằng phần mềm Clustal X 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm TreeView 1.6.6 từ đó phân nhóm xác định mối quan hệ di truyền giữa chúng.
3.12. Xác định mối quan hệ di truyền 11 dòng Trichoderma Việt Nam với dữ liệu của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới liệu của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới
Trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma
phân lập ở Việt Nam đƣợc so sánh với dữ liệu của chúng trên NCBI ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới bằng phần mềm Clustal X 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm TreeView 1.6.6, từ đó xác định mối quan hệ di truyền giữa chúng.
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả ly trích DNA tổng số Trichoderma
Ly trích DNA là một bƣớc khởi đầu rất quan trọng, vì nó là yếu tố quan trọng hàng đầu quyết định sự thành công cho phản ứng PCR sau này. Đối với
Trichoderma, việc ly trích gặp nhiều khó khăn do thành tế bào rất mỏng và mềm vì đƣợc cấu tạo chủ yếu bằng chitin thay vì cellulose nhƣ ở thực vật do đó rất dễ vỡ trong quá trình nghiền, bên trong tế bào chất lại chứa hàm lƣợng lớn polysaccharide, protein và lipid.
Qui trình ly trích DNA của chúng tôi đơn giản nhƣng vẫn thu đƣợc DNA có độ tinh khiết cao. Do ở qui trình này, mẫu đƣợc nghiền trong nitơ lỏng (giúp bảo vệ thành tế bào) đến khi thật mịn để các tế bào tách rời nhau ra, tạo điều kiện thuận lợi cho lysis buffer tác dụng phá thành tế bào. Mặt khác, việc sử dụng phenol/ chloroform/ isoamylalcohol (25: 24: 1), sau đó thêm bƣớc sử dụng chloroform/ isoamylalcohol (24: 1) giúp DNA tách ra khỏi protein và loại hết loại bỏ hết protein, polysaccharide, lipid, RNA có trong mẫu và phenol còn sót lại. Đồng thời, chúng tôi ly tâm tốc độ thấp (4000 vòng/ phút) kết hợp với kéo dài thời gian vừa phải (10