Xanthomonas oryzae pv. oryzae trong điều kiện in vitro
Kết quả đánh giá sơ bộ khả năng đối kháng của 30 chủng vi khuẩn vùng rễ đã ghi nhận được có 17/30 chủng vi khuẩn vùng rễ có khả năng đối kháng với vi khuẩn X. oryzae pv. oryzae qua tất cả các thời điểm khảo sát (chiếm tỷ lệ 56,7% trong 30 chủng khảo sát). Kết quả so sánh khả năng đối kháng của 17 chủng vi khuẩn được trình bày ở (Bảng 3.1) thông qua bán kính vòng vô khuẩn và khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%. Trong 17 chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng tìm được, có 9 chủng thuộc
Bacillus spp., 4 chủng thuộc Pseudomonas spp., 1 chủng là P. fluorescens và 3 chủng chưa xác định.
Vào thời điểm 1 NSKC, 4 chủng vi khuẩn bao gồm chủng 38 (Pseudomonas
sp.), chủng 74 (Bacillus sp.), chủng 97 (Bacillus sp.) và chủng 177 (Pseudomonas sp.) có bán kính vòng vô khuẩn cao và khác biệt ý nghĩa so với các chủng còn lại. Trong đó, chủng 38 và 74 có bán kính vòng vô khuẩn cao nhất và không khác biệt nhau lần lượt là 6,3 mm và 6,6 mm.
Vào thời điểm 3 NSKC, chủng 177 (Pseudomonas sp.) thể hiện khả năng đối kháng cao nhất với bán kính vòng vô khuẩn tăng mạnh và đạt 13,3 mm, kế đến là hai chủng 38 (Pseudomonas sp.) và 74 (Bacillus sp.) thể hiện khả năng đối kháng tương đương nhau.
Thời điểm 5 NSKC, ghi nhận được sự khác biệt rõ rệt giữa ba chủng vi khuẩn, trong đó chủng vi khuẩn 177 (Pseudomonas sp.) vẫn thể hiện khả năng đối kháng cao nhất, kế đến là chủng 38 (Pseudomonas sp.) và chủng 74 (Bacillus sp.). Trong đó, bán kính vòng vô khuẩn của ba chủng đạt lần lượt là 19,7 mm; 18,8 mm và 11,0 mm vào thời điểm 5 NSKC.
Qua bảng số liệu cũng cho thấy, một số chủng vi khuẩn vùng rễ chưa thể hiện khả năng đối kháng vào thời điểm đầu, đến các thời điểm 3 NSKC, 5 NSKC mới ghi
33
nhận được bán kính vòng vô khuẩn, chẳng hạn như chủng 28 (cxđ), chủng 163 (P. fluorescens), chủng 200 (Bacillus sp.) Đồng thời, một số chủng vi khuẩn có bán kính vòng vô khuẩn giảm dần theo thời gian, thậm chí mất luôn khả năng đối kháng vào thời điểm 5 NSKC như chủng 109 (Pseudomonas sp.). Việc các chủng vi khuẩn vùng rễ giảm và mất dần khả năng đối kháng có thể là do dinh dưỡng trong môi trường không còn đủ cho quá trình phát triển và biến dưỡng của các chủng này. Đồng thời, trong quá trình phát triển trong cùng một môi trường, vi khuẩn X. oryzae pv. oryzae đã tiết ra một số độc tố chẳng hạn như phenylacetic acid (Ou, 1985), do đó vi khuẩn gây bệnh có thể chịu đưng tốt hơn và sự phát triển của chúng ít bị ảnh hưởng hơn.
Kết quả cho thấy nhóm vi khuẩn vùng rễ Bacillus và Pseudomonas có khả năng đối kháng cao với vi khuẩn X. oryzae pv. oryzae. Điều này có thể liên quan đến một số cơ chế hoạt động của vi khuẩn vùng rễ như cạnh tranh, tiết ra các chất kháng sinh ức chế mầm bệnh… Satyaprasad và Udayimi (2011) khẳng định rằng nhiều chất kháng sinh tham gia vào sự kích thích tăng trưởng và phòng trừ sinh học đã được xác định bao gồm 2,4-diacetyl phloro glucinol (DAPG), hydrogen cyanide, oomycin A, phenazine, pyoluteorin, pyrrolnitrin, các lipopeptide vòng đuợc sản xuất bởi vi khuẩn
Pseudomonas và iturin, surfactin và fengycin, Zwittermycin A được sản xuất bởi vi khuẩn Bacillus spp. Vi khuẩn vùng rễ có thể sản xuất ra siderophores để cạnh tranh sắt hữu dụng với các vi sinh vật khác. Kết quả nghiên cứu của Chen và ctv. (2011) cho thấy có 42% trong số 220 chủng được phận lập từ ruộng lúa ở tỉnh Yunnan có khả năng sản xuất ra siderophores trên môi trường CAS.
Trong 17 chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng, có đến 9 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus spp. (chiếm tỷ lệ 52,9%). Từ đó, có thể thấy nhóm vi khuẩn Bacillus có tiềm lực cao trong việc ức chế sự phát triển của vi khuẩn X. oryzae pv. oryzae. Điều này có thể là do vi khuẩn Bacillus sở hữu nhiều cơ chế khác nhau như cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống, sản xuất enzym ức chế mầm bệnh, kích thích tính kháng lưu dẫn của cây trồng (Li và ctv., 2011). Suo và ctv. (2011) cho biết có hơn 12 loại kháng sinh đã được tìm thấy bởi vi khuẩn Bacillus. Trong môi trường King’s B có chứa rất ít sắt, mà vi khuẩn Bacillus có khả năng tiết ra siderophores để cạnh tranh và
34
sử dụng có hiệu quả sắt trong môi trường vì thế có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh. Nguyễn Thị Vàng (2013) cho biết cả 4 chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng đối kháng mạnh đối với vi khuẩn X. oryzae pv. oryzae đều có khả năng tạo ra siderophores ở các dạng khác nhau.
Như vậy, ba chủng vi khuẩn gồm 38 (Pseudomonas sp.), 74 (Bacillus sp.) và 177 (Pseudomonas sp.) thể hiện khả năng đối kháng mạnh với bán kính vòng vô khuẩn cao nhất vào tất cả các thời điểm đối với vi khuẩn X. oryzae pv. oryzae, đã được chọn là tác nhân phòng trừ bệnh cháy bìa lá lúa trong điều kiện nhà lưới.
35
Bảng 3.1 Bán kính vòng vô khuẩn thể hiện khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn vùng rễ đối với vi khuẩn X. oryzae pv. oryzae trong điều kiện in vitro
STT Mã vi khuẩn Phân loại Bán kính vòng vô khuẩn (mm)
1 NSKC 3 NSKC 5 NSKC 1 28 cxđ 0,0 f 0,0 g 1,7 f 2 38 Pseudomonas sp. 6,6 a 7,5 b 18,8 b 3 62 Bacillus sp. 1,3 d 1,3 ef 1,2 fg 4 65 Bacillus sp. 1,1 de 1,3 ef 0,6 ghi 5 69 Bacillus sp. 1,9 c 2,3 cd 3,0 de 6 74 Bacillus sp. 6,3 a 7,2 b 11,0 c 7 82 cxđ 0,8 de 0,9 f 0,2 hi 8 97 Bacillus sp. 2,4 bc 2,9 c 3,1 de 9 104 Pseudomonas sp. 0,9 de 2,6 cd 2,7 e 10 109 Pseudomonas sp. 1,1 de 0,0 g 0,0 i 11 113 cxđ 0,6 ef 0,6 fg 3,9 d 12 150 Bacillus sp. 0,6 ef 0,7 fg 1,0 fgh 13 163 P. fluorescens 0,0 f 1,4 ef 1,5 fg 14 164 Bacillus sp. 1,2 de 1,2 ef 3,0 de 15 177 Pseudomonas sp. 2,8 b 13,3 a 19,7 a 16 198 Bacillus sp. 0,7 de 1,0 ef 0,8 f - i 17 200 Bacillus sp. 0,0 f 1,8 de 3,1 de Mức ý nghĩa * * * CV (%) 26,67 22,59 15,58
Ghi chú: Các số trong cùng một cột theo sau bởi một ký tự giống nhau thì không khác biệt ý nghĩa ở mức 5% theo phép thử Duncan. * khác biệt ý nghĩa ở mức 5%.
36
Hình 3.1: Bán kính vòng vô khuẩn thể hiện khả năng đối kháng của vi khuẩn vùng rễ đối với
X. oryzae pv. oryzae vào thời điểm 5 NSKC
38
74
37
3.2. Khả năng ức chế của 8 loại thuốc hóa học đối với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae trong điều kiện in vitro
Kết quả đánh giá khả năng ức chế của 8 loại thuốc hóa học được trình bày trong Bảng 3.2. cho thấy vào tất cả các thời điểm khảo sát chỉ có hai loại thuốc có hiệu quả ức chế là thuốc Super Cook 85WP và dung dịch Bordeaux, khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các loại thuốc còn lại.
Vào thời điểm 1 NSKC, cả hai loại thuốc này thể hiện khả năng ức chế tương đương nhau với trung bình bán kính vòng vô khuẩn dao động trong khoảng 5,7 – 5,8 mm.
Vào các thời điểm 3 NSKC và 5 NSKC, bán kính vòng vô khuẩn của hai loại thuốc có sự khác biệt rõ rệt. Cả hai thời điểm trên, dung dịch Bordeaux đều thể hiện khả năng ức chế cao nhất với trung bình bán kính vòng vô khuẩn đạt 4,2 mm vào thời điểm 5 NSKC, khác biệt có ý nghĩa so với thuốc Super Cook 85WP (3,3 mm). Từ kết quả này, có thể thấy các loại thuốc hóa hóa học có chứa gốc đồng cho hiệu quả ức chế cao đối với vi khuẩn X. oryzae pv. oryzae trong điều kiện in vitro. Điều này có thể liên quan đến một số cơ chế tác động của các loại thuốc gốc đồng mà Trần Văn Hai (2005) cho rằng ion Cu2+ được giải phóng ra có thể làm kết tủa hoặc biến tính các enzym, từ đó ức chế sự phát triển của mầm bệnh.
Tóm lại, dung dịch Bordeaux thể hiện khả năng ức chế cao nhất trong các loại thuốc được khảo sát với trung bình bán kính vòng vô khuẩn cao nhất đối với vi khuẩn
X. oryzae pv. oryzae đã được chọn làm tác nhân phòng trừ bệnh cháy bìa lá lúa trong điều kiện nhà lưới.
38
Bảng 3.2 Bán kính vòng vô khuẩn thể hiện khả năng ức chế của 8 loại thuốc hóa học đối với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae trong điều kiện in vitro
STT Tên thương mại Hoạt chất Bán kính vòng vô khuẩn (mm) 1 NSKC 3 NSKC 5 NSKC
1 SuperCook 85WP Copper Oxychloride 5,7 a 3,7 b 3,3 b
2 Bordeaux Ca(OH)2 + CuSO4 5,8 a 4,4 a 4,2 a
3 Kasumin 2SL Kasugamycin 0,0 b 0,0 c 0,0 c
4 Ditacin 8SL Ningnamycin 0,0 b 0,0 c 0,0 c
5 Starner 20WP Oxolinic acid 0,0 b 0,0 c 0,0 c
6 Xantocin 40WP Bronopol 0,0 b 0,0 c 0,0 c
7 Visen 20SC Saisentong 0,0 b 0,0 c 0,0 c
8 Dung dịch vôi Ca(OH)2 0,0 b 0,0 c 0,0 c
Mức ý nghĩa * * *
CV (%) 12,90 27,61 23,85
Ghi chú: Các số trong cùng một cột theo sau bởi một ký tự giống nhau thì không khác biệt ý nghĩa ở mức 5% theo phép thử Duncan. * khác biệt ý nghĩa ở mức 5%.
Hình 3.2: Bán kính vòng vô khuẩn thể hiện khả năng ức chế của Super Cook 85WP và Bordeaux trong điều kiện in vitro vào thời điểm 3 NSKC (A) và 5 NSKC (B)
Bordeaux Bordeaux
Super Cook 85 Super Cook 85
39
3.3. Hiệu quả phòng trị bệnh của 3 chủng vi khuẩn vùng rễ và dung dịch Bordeaux đối với bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae
gây ra trong điều kiện nhà lưới
Kết quả đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh cháy bìa lá lúa được thể hiện qua chiều dài vết bệnh ở (Bảng 3.3) và cấp bệnh ở (Bảng 3.4).
Chiều dài vết bệnh: Qua (Bảng 3.3) cho thấy:
Vào thời điểm 3 NSKLB, tất cả các nghiệm thức có xử lý vi khuẩn vùng rễ và dung dịch Bordeaux đều chưa thể hiện hiệu quả phòng trị bệnh với chiều dài vết bệnh không khác biệt ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng.
Thời điểm 11 NSKLB, các nghiệm thức phun vi khuẩn 74 sau, phun vi khuẩn 177 trước, phun dung dịch Bordeaux trước thể hiện hiệu quả giảm bệnh tương đương nhau với chiều dài vết bệnh dao động từ 18,0 – 18,7 cm, thấp hơn và khác biệt ý nghĩa so với đối chứng (21,4 cm).
Thời điểm 15 NSKLB, các nghiệm thức phun vi khuẩn 177 trước, phun dung dịch Bordeaux trước, phun dung dịch Bordeaux sau có chiều dài vết bệnh lần lượt là 25,9 cm; 25,8 cm và 26,7 cm thấp hơn và khác biệt ý nghĩa so với đối chứng (29,8 cm). Đến thời điểm 19 NSKLB, các nghiệm thức phun vi khuẩn 38 sau, phun vi khuẩn 74 trước, phun dung dịch Bordeaux trước và dung dịch Bordeaux sau cho chiều dài vết bệnh lần lượt là 31,5 cm; 29,8 cm; 28,5 cm và 30,7 cm thấp hơn và khác biệt ý nghĩa so với đối chứng (34,9 cm).
Cấp bệnh:
Qua (Bảng 3.4) cho thấy:
Thời điểm 3 NSKLB, các nghiệm thức phun vi khuẩn 38 trước, phun vi khuẩn 38 sau, phun vi khuẩn 177 trước và phun dung dịch Bordeaux trước đều có trung bình cấp bệnh thấp hơn và khác biệt ý nghĩa so với đối chứng.
40
Thời điểm 11 NSKLB, chỉ có nghiệm thức phun vi khuẩn 74 sau là có cấp bệnh thấp hơn và khác biệt ý nghĩa so với đối chứng.
Thời điểm 15 NSKLB, chỉ có hai nghiệm thức phun trước và phun sau dung dịch Bordeaux cho cấp bệnh thấp hơn và khác biệt ý nghĩa so với đối chứng.
Đến thời điểm 19 NSKLB, trừ hai nghiệm thức phun vi khuẩn 38 trước và phun vi khuẩn 177 sau, các nghiệm thức xử lý còn lại đều có cấp bệnh thấp hơn và khác biệt ý nghĩa so với đối chứng.
Như vậy, qua hai chỉ tiêu đánh giá về chiều dài vết bệnh và cấp bệnh có thể thấy ba chủng vi khuẩn vùng rễ thể hiện hiệu quả giảm bệnh cháy bìa lá lúa khi áp dụng ra ngoài nhà lưới nhưng khác nhau tùy theo thời điểm khảo sát. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Gao và ctv. (2011) rằng trong 111 chủng vi khuẩn được phân lập từ rễ, thân và lá của cây lúa ở tỉnh Yunnan, có 35 chủng vi khuẩn nội sinh rễ thể hiện hiệu quả ngăn chặn đối với bệnh do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây ra. Điều này có thể do vi khuẩn vùng rễ sở hữu nhiều cơ chế ức chế mầm bệnh khác nhau. Ngoài một số cơ chế ức chế trực tiếp như cạnh tranh, tiết enzym, tiết các chất kháng sinh, các vi khuẩn vùng rễ còn có khả năng kích thích tăng trưởng cây trồng (Satyaprasad và ctv., 2011). Kumar và Udayimi (2011) cho biết việc khảo sát trên các chủng vi khuẩn tiềm năng kích thích tăng trưởng cây trồng như Bacillus pumilus
OM10, Bacillus subtilis PfS1, Bacillus pumilus PfR5, Klebsiella sp. BM8 và
Pseudomonas aeruginosa LC6 đã được chứng minh. Hiện tượng kích thích tăng trưởng cây trồng có thể được biểu hiện thông qua khả năng sản xuất IAA, có ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng và phát triển của rễ, theo đó giúp cây tăng cường hấp thu chất dinh dưỡng.
Tuy nhiên, hiệu quả phòng trị bệnh của các chủng vi khuẩn đối kháng không ổn định và chưa thể hiện rõ rệt, tùy vào từng thời điểm khảo sát; không khác biệt ý nghĩa thống kê giữa biện pháp phun trước và phun sau. Cả hai nghiệm thức xử lý phun trước và phun sau với chủng vi khuẩn 38 không cho hiệu quả về chiều dài vết bệnh, nhưng cả hai nghiệm thức phun trước và phun sau lại cho hiệu quả về cấp bệnh vào 3 NSKLB,
41
các nghiệm thức phun vi khuẩn 38 không thể hiện hiệu quả khác biệt vào thời điểm 11 NSKLB, đến thời điểm 19 NSKLB chỉ có nghiệm thức xử lý phun sau cho trung bình chiều dài vết bệnh và trung bình cấp bệnh thấp hơn và khác biệt ý nghĩa so với đối chứng. Đối với các nghiệm thức xử lý với chủng vi khuẩn 74, chỉ có nghiệm thức phun sau cho trung bình chiều dài vết bệnh và trung bình cấp bệnh thấp hơn và khác biệt ý nghĩa với đối chứng vào thời điểm 11 NSKLB, đến thời điểm 19 NSKLB cả hai nghiệm thức phun trước và phun sau đều cho trung bình cấp bệnh khác biệt ý nghĩa so với đối chứng. Đối với các nghiệm thức xử lý với chủng vi khuẩn 177, chỉ có nghiệm thức phun trước là cho hiệu quả vào một số thời điểm, nghiệm thức phun sau không thể hiện hiệu quả khi trung bình chiều dài vết bệnh và trung bình cấp bệnh đều không khác biệt ý nghĩa so với đối chứng vào tất cả các thời điểm khảo sát.
Việc các chủng vi khuẩn đối kháng khi áp dụng ra ngoài nhà lưới chưa cho hiệu quả phòng trị bệnh cháy bìa lá lúa ổn định và chưa thật sự rõ rệt có thể do nhiều nguyên nhân. Phương pháp xử lý vi khuẩn gây bệnh và xử lý các chủng vi khuẩn đối kháng áp dụng như các nghiên cứu trước đây có thể chưa thật sự phù hợp. Vi khuẩn gây bệnh được xử lý dựa trên phương pháp cắt chóp lá, vì thế vi khuẩn gây bệnh có điều kiện xâm nhập và tấn công vào trong mô cây. Trong khi đó, các chủng vi khuẩn đối kháng được xử lý bằng phuơng pháp phun ướt đều tán lá. Khi đó, vi khuẩn đối kháng ít có điều kiện tiếp xúc và ức chế vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt khi vi khuẩn gây bệnh tấn công vào mô cây và lan rộng. Mặt khác, vi khuẩn đối kháng vốn đuợc phân lập từ vùng rễ và vùng đất xung quanh rễ cây, vốn thích nghi với điều kiện sinh thái nơi vùng rễ. Vì thế, khi xử lý lên lá, tức là thay đổi điều kiện sinh thái từ vùng rễ đến điều kiện trên tán lá cây, có thể làm hạn chế khả năng thích nghi của vi khuẩn đối kháng, từ đó vi khuẩn ít có khả năng định vị trên bề mặt tán lá cây và mật số có thể không còn đủ để ức chế lại vi khuẩn gây bệnh.
Kết quả cũng cho thấy, nghiệm thức xử lý với dung dịch Bordeaux cho hiệu quả phòng trị bệnh bệnh cháy bìa lá lúa tương đối ổn định và rõ rệt hơn so với các chủng vi