với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh cháy bìa lá lúa trong điều kiện in vitro
Mục đích
Khảo sát khả năng ức chế của 8 loại thuốc hoá học đối với vi khuẩn Xoo3 gây bệnh cháy bìa lá lúa trong điều kiện phòng thí nghiệm nhằm chọn ra một loại thuốc hoá học có khả năng ức chế cao nhất để tiếp tục khảo sát ngoài nhà lưới.
Cách tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị nguồn vi khuẩn gây bệnh: tương tự như thí nghiệm 1.
Chuẩn bị thuốc hoá học: Mỗi loại thuốc được pha bằng 25 ml nước cất thanh trùng trong ống Falcon đúng như nồng độ khuyến cáo ở bảng 2.2.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố trên đĩa petri gồm 8 nghiệm thức là 8 loại thuốc hóa học với 5 lần lặp lại.
Cách thực hiện: Rút 300 µl huyền phù vi khuẩn gây bệnh trong bình tam giác cho vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường King’s agar đã được nấu tan và giữ ở 53oC trong nồi chưng cách thủy. Khuấy đều bằng Vortex và đổ vào đĩa petri thanh trùng, để nguội. Mỗi đĩa petri được đánh dấu 4 điểm đối xứng nhau qua tâm. Nhúng khoanh giấy thấm thanh trùng đường kính 5 mm vào dung dịch thuốc đã được pha sẵn và đặt vào 4 điểm đã được đánh dấu. Mỗi khoanh giấy thấm đặt vào một điểm, tương ứng với một loại thuốc hoá học. Đặt đĩa petri đã thử đối kháng ở nhiệt độ phòng và theo dõi lấy chỉ tiêu.
28
Hình 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế của 8 loại thuốc hoá học đối với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae.
Chỉ tiêu ghi nhận: Tiến hành lấy chỉ tiêu khi bắt đầu xuất hiện vòng vô khuẩn. Đo bán kính vòng vô khuẩn vào các thời điểm 1, 3 và 5 ngày sau khi cấy (NSKC).
2.2.3. Thí nghiệm 3: Đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh của các chủng vi khuẩn đối kháng và dung dịch Bordeaux đối với bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn
Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây ra trong điều kiện nhà lưới Mục đích
Nhằm đánh giá hiệu quả của các chủng vi khuẩn đối kháng và thuốc hóa học (được chọn từ Thí nghiệm 1 và Thí nghiệm 2) đối với bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xoo3 gây ra trong điều kiện nhà lưới và tìm ra biện pháp xử lý đạt hiệu quả phòng trị cao để ứng dụng ngoài đồng.
Vật liệu
- Nguồn vi khuẩn lây bệnh: Xoo3
- Nguồn vi khuẩn đối kháng: 3 chủng vi khuẩn 38 (Pseudomonas sp.), 74 (Bacillus sp.) và 177 (Pseudomonas sp.) (được chọn từ Thí nghiệm 1)
- Vôi bột và CuSO4 để pha dung dịch Bordeaux - Giống lúa Jasmine 85 và các vật liệu khác
Môi trường King’s B chứa vi khuẩn X. oryzae pv. oryzae
Khoanh giấy thấm có chứa dung dịch thuốc hoá học
29
Các tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị lúa thí nghiệm:
Chuẩn bị chậu nhựa trồng lúa có kích thước 17,5 x 12 cm, cho vào mỗi chậu 1 kg đất. Cho nước vào ngâm và xả phèn trong 2 tuần. Hạt giống lúa Jasmine 85 được xử lý 2 sôi 3 lạnh trong 30 phút, sau đó đem ủ với nhiệt độ 37oC trong 48 giờ cho hạt nảy mầm. Đem hạt gieo vào chậu, mỗi chậu gieo 20 hạt thành 2 hàng song song. Sau khi gieo được 7 ngày thì tỉa lại còn 10 hạt/chậu. Lúa được chăm sóc, tưới nước, bón phân đảm bảo cho lúa phát triển tốt. Lượng phân bón được quy ra diện tích chậu nhựa từ công thức phân bón của Nguyễn Ngọc Đệ (1998) với công thức 120 N - 40 P2O5 - 30 K2O và chia ra thành 5 lần bón như sau:
Bón lót: 100% P2O5
Bón thúc lần 1 (7 ngày sau khi gieo): ¼ N + 100% K2O Bón thúc lần 2 (15 ngày sau khi gieo): ¼ N
Bón thúc lần 3 (20 ngày sau khi gieo): ¼ N Bón thúc lần 4 (30 ngày sau khi gieo): ¼ N
Phân bón được hòa tan vào 2750 ml H2O, tưới 50 ml/chậu và sử dụng phân đơn dạng hạt.
Liều lượng sử dụng cho mỗi lần bón: urê: 0,55 g/chậu; super lân: 0,56 g/chậu; KCl: 0,105 g/chậu. Phân urê, super lân và KCl được hòa tan vào nước và tưới đều cho mỗi chậu. Mực nước trong chậu khoảng 2 cm, chăm sóc và bảo vệ cây lúa không bị sâu bệnh tấn công.
Chuẩn bị nguồn vi khuẩn lây bệnh: Chủng vi khuẩn Xoo3 gây bệnh được nuôi cấy trên đĩa petri chứa môi trường Wakimoto cải tiến trong 4 ngày. Sau đó dùng nước muối sinh lý 0,9% thu huyền phù vi khuẩn. Lắc đều và pha với nước cất vô trùng để đạt mật số 1011 cfu/ml dựa trên đường chuẩn vi khuẩn.
Chuẩn bị nguồn vi khuẩn đối kháng: 3 chủng vi khuẩn đối kháng 38 (Pseudomonas sp.), 74 (Bacillus sp.) và 177 (Pseudomonas sp.) được nuôi cấy trên đĩa petri chứa môi trường King’s B trong 2 ngày. Sau đó dùng nước muối sinh lý 0,9% cạo
30
lấy huyền phù vi khuẩn. Lắc đều và pha ra mật số 108 cfu/ml dựa trên đường chuẩn vi khuẩn.
Chuẩn bị dung dịch Bordeaux: dung dịch Bordeaux được pha với nồng độ (1:1:100) gồm 1 g CaCO3 + 1 g CuSO4 + 100 ml nước cất thanh trùng.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 9 nghiệm thức với 5 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là một chậu lúa. Mỗi chủng vi khuẩn và dung dịch Bordeaux được phun ở 2 thời điểm: 1 ngày trước khi lây bệnh (PT) và 2 ngày sau khi lây bệnh (PS):
- Nghiệm thức 1: phun lên lá lúa chủng vi khuẩn 38 (Pseudomonas sp.) vào 1 ngày trước khi lây bệnh (38T)
- Nghiệm thức 2: phun lên lá lúa chủng vi khuẩn 38 (Pseudomonas sp.) vào 2 ngày sau khi lây bệnh (38S)
- Nghiệm thức 3: phun lên lá lúa chủng vi khuẩn 74 (Bacillus sp.) vào 1 ngày trước khi lây bệnh (74T)
- Nghiệm thức 4: phun lên lá lúa chủng vi khuẩn 74 (Bacillus sp.) vào 2 ngày sau khi lây bệnh (74S)
- Nghiệm thức 5: phun lên lá lúa chủng vi khuẩn 177 (Pseudomonas sp.) vào 1 ngày trước khi lây bệnh (177T)
- Nghiệm thức 6: phun lên lá lúa chủng vi khuẩn 177 (Pseudomonas sp.) vào 2 ngày sau khi lây bệnh (177S)
- Nghiệm thức 7: phun lên lá lúa dung dịch Bordeaux vào 1 ngày trước khi lây bệnh (BorT)
- Nghiệm thức 8: phun lên lá lúa dung dịch Bordeaux vào 2 ngày sau khi lây bệnh (BorS)
- Nghiệm thức 9: đối chứng, chỉ lây bệnh, không phun vi khuẩn đối kháng và thuốc hoá học (ĐC)
31
Cách xử lý vi khuẩn đối kháng và thuốc hóa học:
Cách xử lý các nghiệm thức PT: phun đều vi khuẩn đối kháng lên mặt lá ở mật số 108 cfu/ml (200 ml/nghiệm thức) hoặc dung dịch Bordeaux (200 ml/nghiệm thức) vào 1 ngày trước khi lây bệnh.
Cách xử lý các nghiệm thức PS: phun đều vi khuẩn đối kháng lên mặt lá ở mật số 108 cfu/ml (200 ml/nghiệm thức) hoặc dung dịch Bordeaux (200 ml/nghiệm thức) vào 2 ngày sau khi lây bệnh.
Cách lây bệnh nhân tạo:
Tiến hành lây bệnh nhân tạo khi cây lúa được 50 ngày bằng phương pháp cắt chóp lá. Nhúng kéo vào huyền phù vi khuẩn gây bệnh có mật số 1011 cfu/ml trước khi cắt, lá lúa được cắt từ chóp lá xuống 2 cm. Sau khi lây bệnh nhân tạo, các chậu lúa được chuyển vào phòng ủ bệnh ở nhiệt độ 25oC trong 24 giờ, tạo ẩm độ cao cho bệnh phát triển. Sau đó chuyển ra nhà lưới có hệ thống phun sương tự động (1 giờ/lần) và có che mát.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Thời điểm xuất hiện bệnh
- Khi bắt đầu xuất hiện bệnh, đo chiều dài vết bệnh/chiều dài lá và tính ra cấp bệnh theo thang đánh giá của Kaufman và ctv. (1973) gồm 5 cấp bệnh như sau: Cấp 1: Không có vết bệnh Cấp 3: Vết bệnh <1/4 chiều dài lá Cấp 5: Vết bệnh từ ¼ - 1/2 chiều dài lá Cấp 7: Vết bệnh >1/2 chiều dài lá Cấp 9: Vết bệnh lan ra toàn lá
Xử lý số liệu và thống kê: Các số liệu được xử lý trên phần mềm Microsoft Office
32
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
3.1. Khả năng đối kháng của 30 chủng vi khuẩn vùng rễ đối với vi khuẩn
Xanthomonas oryzae pv. oryzae trong điều kiện in vitro
Kết quả đánh giá sơ bộ khả năng đối kháng của 30 chủng vi khuẩn vùng rễ đã ghi nhận được có 17/30 chủng vi khuẩn vùng rễ có khả năng đối kháng với vi khuẩn X. oryzae pv. oryzae qua tất cả các thời điểm khảo sát (chiếm tỷ lệ 56,7% trong 30 chủng khảo sát). Kết quả so sánh khả năng đối kháng của 17 chủng vi khuẩn được trình bày ở (Bảng 3.1) thông qua bán kính vòng vô khuẩn và khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%. Trong 17 chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng tìm được, có 9 chủng thuộc
Bacillus spp., 4 chủng thuộc Pseudomonas spp., 1 chủng là P. fluorescens và 3 chủng chưa xác định.
Vào thời điểm 1 NSKC, 4 chủng vi khuẩn bao gồm chủng 38 (Pseudomonas
sp.), chủng 74 (Bacillus sp.), chủng 97 (Bacillus sp.) và chủng 177 (Pseudomonas sp.) có bán kính vòng vô khuẩn cao và khác biệt ý nghĩa so với các chủng còn lại. Trong đó, chủng 38 và 74 có bán kính vòng vô khuẩn cao nhất và không khác biệt nhau lần lượt là 6,3 mm và 6,6 mm.
Vào thời điểm 3 NSKC, chủng 177 (Pseudomonas sp.) thể hiện khả năng đối kháng cao nhất với bán kính vòng vô khuẩn tăng mạnh và đạt 13,3 mm, kế đến là hai chủng 38 (Pseudomonas sp.) và 74 (Bacillus sp.) thể hiện khả năng đối kháng tương đương nhau.
Thời điểm 5 NSKC, ghi nhận được sự khác biệt rõ rệt giữa ba chủng vi khuẩn, trong đó chủng vi khuẩn 177 (Pseudomonas sp.) vẫn thể hiện khả năng đối kháng cao nhất, kế đến là chủng 38 (Pseudomonas sp.) và chủng 74 (Bacillus sp.). Trong đó, bán kính vòng vô khuẩn của ba chủng đạt lần lượt là 19,7 mm; 18,8 mm và 11,0 mm vào thời điểm 5 NSKC.
Qua bảng số liệu cũng cho thấy, một số chủng vi khuẩn vùng rễ chưa thể hiện khả năng đối kháng vào thời điểm đầu, đến các thời điểm 3 NSKC, 5 NSKC mới ghi
33
nhận được bán kính vòng vô khuẩn, chẳng hạn như chủng 28 (cxđ), chủng 163 (P. fluorescens), chủng 200 (Bacillus sp.) Đồng thời, một số chủng vi khuẩn có bán kính vòng vô khuẩn giảm dần theo thời gian, thậm chí mất luôn khả năng đối kháng vào thời điểm 5 NSKC như chủng 109 (Pseudomonas sp.). Việc các chủng vi khuẩn vùng rễ giảm và mất dần khả năng đối kháng có thể là do dinh dưỡng trong môi trường không còn đủ cho quá trình phát triển và biến dưỡng của các chủng này. Đồng thời, trong quá trình phát triển trong cùng một môi trường, vi khuẩn X. oryzae pv. oryzae đã tiết ra một số độc tố chẳng hạn như phenylacetic acid (Ou, 1985), do đó vi khuẩn gây bệnh có thể chịu đưng tốt hơn và sự phát triển của chúng ít bị ảnh hưởng hơn.
Kết quả cho thấy nhóm vi khuẩn vùng rễ Bacillus và Pseudomonas có khả năng đối kháng cao với vi khuẩn X. oryzae pv. oryzae. Điều này có thể liên quan đến một số cơ chế hoạt động của vi khuẩn vùng rễ như cạnh tranh, tiết ra các chất kháng sinh ức chế mầm bệnh… Satyaprasad và Udayimi (2011) khẳng định rằng nhiều chất kháng sinh tham gia vào sự kích thích tăng trưởng và phòng trừ sinh học đã được xác định bao gồm 2,4-diacetyl phloro glucinol (DAPG), hydrogen cyanide, oomycin A, phenazine, pyoluteorin, pyrrolnitrin, các lipopeptide vòng đuợc sản xuất bởi vi khuẩn
Pseudomonas và iturin, surfactin và fengycin, Zwittermycin A được sản xuất bởi vi khuẩn Bacillus spp. Vi khuẩn vùng rễ có thể sản xuất ra siderophores để cạnh tranh sắt hữu dụng với các vi sinh vật khác. Kết quả nghiên cứu của Chen và ctv. (2011) cho thấy có 42% trong số 220 chủng được phận lập từ ruộng lúa ở tỉnh Yunnan có khả năng sản xuất ra siderophores trên môi trường CAS.
Trong 17 chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng, có đến 9 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus spp. (chiếm tỷ lệ 52,9%). Từ đó, có thể thấy nhóm vi khuẩn Bacillus có tiềm lực cao trong việc ức chế sự phát triển của vi khuẩn X. oryzae pv. oryzae. Điều này có thể là do vi khuẩn Bacillus sở hữu nhiều cơ chế khác nhau như cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống, sản xuất enzym ức chế mầm bệnh, kích thích tính kháng lưu dẫn của cây trồng (Li và ctv., 2011). Suo và ctv. (2011) cho biết có hơn 12 loại kháng sinh đã được tìm thấy bởi vi khuẩn Bacillus. Trong môi trường King’s B có chứa rất ít sắt, mà vi khuẩn Bacillus có khả năng tiết ra siderophores để cạnh tranh và
34
sử dụng có hiệu quả sắt trong môi trường vì thế có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh. Nguyễn Thị Vàng (2013) cho biết cả 4 chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng đối kháng mạnh đối với vi khuẩn X. oryzae pv. oryzae đều có khả năng tạo ra siderophores ở các dạng khác nhau.
Như vậy, ba chủng vi khuẩn gồm 38 (Pseudomonas sp.), 74 (Bacillus sp.) và 177 (Pseudomonas sp.) thể hiện khả năng đối kháng mạnh với bán kính vòng vô khuẩn cao nhất vào tất cả các thời điểm đối với vi khuẩn X. oryzae pv. oryzae, đã được chọn là tác nhân phòng trừ bệnh cháy bìa lá lúa trong điều kiện nhà lưới.
35
Bảng 3.1 Bán kính vòng vô khuẩn thể hiện khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn vùng rễ đối với vi khuẩn X. oryzae pv. oryzae trong điều kiện in vitro
STT Mã vi khuẩn Phân loại Bán kính vòng vô khuẩn (mm)
1 NSKC 3 NSKC 5 NSKC 1 28 cxđ 0,0 f 0,0 g 1,7 f 2 38 Pseudomonas sp. 6,6 a 7,5 b 18,8 b 3 62 Bacillus sp. 1,3 d 1,3 ef 1,2 fg 4 65 Bacillus sp. 1,1 de 1,3 ef 0,6 ghi 5 69 Bacillus sp. 1,9 c 2,3 cd 3,0 de 6 74 Bacillus sp. 6,3 a 7,2 b 11,0 c 7 82 cxđ 0,8 de 0,9 f 0,2 hi 8 97 Bacillus sp. 2,4 bc 2,9 c 3,1 de 9 104 Pseudomonas sp. 0,9 de 2,6 cd 2,7 e 10 109 Pseudomonas sp. 1,1 de 0,0 g 0,0 i 11 113 cxđ 0,6 ef 0,6 fg 3,9 d 12 150 Bacillus sp. 0,6 ef 0,7 fg 1,0 fgh 13 163 P. fluorescens 0,0 f 1,4 ef 1,5 fg 14 164 Bacillus sp. 1,2 de 1,2 ef 3,0 de 15 177 Pseudomonas sp. 2,8 b 13,3 a 19,7 a 16 198 Bacillus sp. 0,7 de 1,0 ef 0,8 f - i 17 200 Bacillus sp. 0,0 f 1,8 de 3,1 de Mức ý nghĩa * * * CV (%) 26,67 22,59 15,58
Ghi chú: Các số trong cùng một cột theo sau bởi một ký tự giống nhau thì không khác biệt ý nghĩa ở mức 5% theo phép thử Duncan. * khác biệt ý nghĩa ở mức 5%.
36
Hình 3.1: Bán kính vòng vô khuẩn thể hiện khả năng đối kháng của vi khuẩn vùng rễ đối với
X. oryzae pv. oryzae vào thời điểm 5 NSKC
38
74
37
3.2. Khả năng ức chế của 8 loại thuốc hóa học đối với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae trong điều kiện in vitro
Kết quả đánh giá khả năng ức chế của 8 loại thuốc hóa học được trình bày trong Bảng 3.2. cho thấy vào tất cả các thời điểm khảo sát chỉ có hai loại thuốc có hiệu quả ức chế là thuốc Super Cook 85WP và dung dịch Bordeaux, khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các loại thuốc còn lại.
Vào thời điểm 1 NSKC, cả hai loại thuốc này thể hiện khả năng ức chế tương đương nhau với trung bình bán kính vòng vô khuẩn dao động trong khoảng 5,7 – 5,8 mm.
Vào các thời điểm 3 NSKC và 5 NSKC, bán kính vòng vô khuẩn của hai loại thuốc có sự khác biệt rõ rệt. Cả hai thời điểm trên, dung dịch Bordeaux đều thể hiện khả năng ức chế cao nhất với trung bình bán kính vòng vô khuẩn đạt 4,2 mm vào thời điểm 5 NSKC, khác biệt có ý nghĩa so với thuốc Super Cook 85WP (3,3 mm). Từ kết quả này, có thể thấy các loại thuốc hóa hóa học có chứa gốc đồng cho hiệu quả ức chế cao đối với vi khuẩn X. oryzae pv. oryzae trong điều kiện in vitro. Điều này có thể liên quan đến một số cơ chế tác động của các loại thuốc gốc đồng mà Trần Văn Hai (2005) cho rằng ion Cu2+ được giải phóng ra có thể làm kết tủa hoặc biến tính các enzym, từ đó ức chế sự phát triển của mầm bệnh.
Tóm lại, dung dịch Bordeaux thể hiện khả năng ức chế cao nhất trong các loại thuốc được khảo sát với trung bình bán kính vòng vô khuẩn cao nhất đối với vi khuẩn
X. oryzae pv. oryzae đã được chọn làm tác nhân phòng trừ bệnh cháy bìa lá lúa trong