Mẫu cấy : các hạt lúa giống VĐ20
Điều kiện nuơi cấy : mơi trƣờng trƣớc khi cấy đƣợc hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1atm trong thời gian 20 phút.
Phịng nuơi cấy:
- Cƣờng độ ánh sáng 2000 lux - Nhiệt độ : 27 ± 2o
C - Ẩm độ 70%- 80%
- Thời gian chiếu sáng : 16h/ngày
3.2.4 Nhân sinh khối và giữ giống vi khuẩn
Chủng 1019 đƣợc giữ trong glycerol 10%, sau đĩ phân lập trên mơi trƣờng MMS + 1% methanol.
3.2.5 Mơi trƣờng nuơi cấy
Mơi trƣờng nuơi cấy là mơi trƣờng cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) (Phụ lục 1).
Mơi trƣờng phân lập và làm thuần chủng 1019 là mơi trƣờng MMS (methanol mineral salts) (Phụ lục 2): Mơi trƣờng MMS đƣợc thanh trùng bằng cách hấp ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút, sau đĩ để nguội và bổ sung methanol vào mơi trƣờng với thể tích từ 0,1 đến 0,2%, mơi trƣờng rắn cĩ bổ sung agar 20g/l trƣớc khi hấp. Hầu hết các chủng PPFM đều khơng cần vitamine hay các nhân tố tăng trƣởng khác trong quá trình tăng sinh.
Mơi trƣờng giữ giống chủng 1019 là mơi trƣờng Glycerol-Pepton Agar (Phụ lục 3).
* Các mơi trường đều được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút.
Các thành phần khác: - Đƣờng: 20g/l - Agar: 7g/l
pH mơi trƣờng trƣớc khi hấp: 5,7 – 5,8 Các chất kích thích sinh trƣởng:
- BAP (6- benzylamino purine) - NAA (α- naphthaleneacetic acid)
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1 Tạo vật liệu khởi đầu (mơ sẹo)
Các hạt lúa giống VĐ 20 sau khi khử trùng đƣợc cấy vào mơi trƣờng MS + 2 mg/l 2,4- D để tạo mơ sẹo [16].
Khử trùng mẫu:
Hạt lúa
bĩc vỏ trấu Rửa xà bơng trong 5-10 phút
Rửa sạch bằng nƣớc máy mang vơ tủ cấy Tráng bằng nƣớc cất vơ trùng
Lắc cồn 70o trong 1 phút
Lắc Javel (1 Javel:3 H2O) xấp mặt hạt đổ Javel
Rửa bằng nƣớc cất vơ trùng 3 lần
Gấp vào cấy
Các mẫu cấy đƣợc đặt trong tối, nhiệt độ 27 ± 2oC, ẩm độ 72%.
Theo dõi sự hình thành và phát triển của mơ sẹo sau 2, 3 tuần, sau đĩ sử dụng mơ sẹo làm vật liệu thí nghiệm.
Hình 3.2: Hạt lúa đã khử trùng trên mơi trƣờng tạo sẹo
3.3.2 Nhân sinh khối vi khuẩn
Nhân sinh khối vi khuẩn: vi khuẩn đƣợc cấy vào mơi trƣờng MMS (sử dụng phƣơng pháp đo OD để đạt mật độ 1010
tế bào/ml), lắc ở 37oC sau 87 giờ, sử dụng để bổ sung vào mơi trƣờng thí nghiệm.
3.3.3 Nội dung thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, tổng số mẫu ở mỗi nghiệm thức là 30 mẫu.
* Xử lý số liệu:
Phân tích thống kê: số liệu đƣợc xử lý thống kê theo phần mềm MSTATC, sau đĩ dựa vào giá trị Prob trong bảng ANOVA để quyết định nên trắc nghiệm phân hạng hay khơng. Nếu cĩ, dùng trắc nghiệm LSD hoặc trắc nghiệm Ducan, ở mức độ tin cậy 0,01 để đánh giá kết quả thí nghiệm.
3.3.3.1 Thí nghiệm 1: “ Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ 20” của giống lúa VĐ 20”
Mục tiêu thí nghiệm: xác định lại nồng độ 2,4-D tốt nhất cho khả năng nhân
sẹo ở giống lúa VĐ20.
Theo Đồn Thị Phƣơng Thùy [6] cĩ sự khác nhau giữa nồng độ auxin thích hợp cho sự hình thành mơ sẹo và nồng độ auxin thích hợp cho sự tăng trƣởng mơ sẹo của các giống lúa khác nhau, ở thí nghiệm này thay đổi nồng độ 2,4-D để xác định lại nồng độ auxin thích hợp cho khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20.
Mơi trƣờng nền (MTN): khống MS + 7g agar + 20g đƣờng + 1mg/l NAA +
0,5 mg/l BAP, bổ sung nồng độ 2,4-D [6]. Mẫu cấy: mơ sẹo cĩ diện tích bằng nhau. NT1: MTN + 0 mg/l 2,4-D
NT3: MTN + 2 mg/l 2,4-D NT4: MTN + 3 mg/l 2,4-D
Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi sự phát triển mơ sẹo sau khi cho nhiễm khuẩn ở các nồng độ khác nhau, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu:
theo dõi sự thay đổi trạng thái và kết cấu mơ sẹo: kích thƣớc, hình dạng, màu sắc.
3.3.3.2 Thí nghiệm 2: “ Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA lên khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20” tái sinh chồi từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20”
Mục tiêu thí nghiệm: xác định nồng độ BAP/NAA tốt nhất lên khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo.
Mơi trƣờng nền: khống MS + 7g agar + 20g đƣờng + bổ sung nồng độ BAP/NAA.
Mẫu cấy: mơ sẹo
NT1: MTN + 1 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA NT2: MTN + 1 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA NT3: MTN + 1 mg/l BAP + 1mg/l NAA NT4: MTN + 2 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA NT5: MTN + 2 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA NT6: MTN + 2 mg/l BAP + 1mg/l NAA
Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi khả năng tạo chồi từ mơ sẹo, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu:
tỷ lệ mẫu tái sinh (%) = (số mẫu tái sinh / số mẫu cấy)*100 số chồi trên mẫu = tổng số chồi / mẫu
3.3.3.3 Thí nghiệm 3: “ Ảnh hƣởng của nồng độ NAA lên khả năng tái sinh rễ từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20” từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20”
Mục tiêu thí nghiệm: xác định nồng độ NAA tốt nhất lên khả năng tái sinh rễ
Mơi trƣờng nền: khống MS + 7g agar + 20g đƣờng, bổ sung nồng độ NAA.
Mẫu cấy: mơ sẹo
NT1: MTN + 0,5 mg/l NAA
NT2: MTN + 1 mg/l NAA NT3: MTN + 1,5 mg/l NAA NT4: MTN + 2 mg/l NAA
Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi khả năng tái sinh rễ từ mơ sẹo ở các nồng độ nhiễm khuẩn khác nhau. Các chỉ tiêu:
tỷ lệ ra rễ (%) = (số mẫu ra rễ / tổng số mẫu)*100 số rễ trên mẫu = tổng số rễ / mẫu
3.3.3.4 Thí nghiệm 4: “ Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tạo mơ sẹo của giống lúa VĐ 20” của giống lúa VĐ 20”
Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tạo
mơ sẹo của giống lúa VĐ20.
Mơi trƣờng nền: khống MS + 7g agar + 20g đƣờng + 2mg/l 2,4-D.
Mẫu cấy: hạt lúa đã khử
Cách thực hiện: mẫu đƣợc cấy vào chai nƣớc biển + bổ sung vào mơi trƣờng thí nghiệm với các nghiệm thức bổ sung 0; 0,5; 1; 1,5 ml dung dịch vi khuẩn. NT1: MTN + 0 ml dung dịch vi khuẩn + dung dịch tăng sinh MMS NT2: MTN + 0,5 ml dung dịch vi khuẩn
NT3: MTN + 1 ml dung dịch vi khuẩn NT4: MTN + 1,5 ml dung dịch vi khuẩn
Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi sự phát triển mơ sẹo sau khi cho nhiễm khuẩn ở các nồng độ khác nhau, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu:
theo dõi sự thay đổi trạng thái và kết cấu mơ sẹo: kích thƣớc, hình dạng, màu sắc.
3.3.3.5 Thí nghiệm 5: “ Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20” giống lúa VĐ20”
Mục tiêu thí nghiệm: Khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng nhân
sẹo.
Mơi trƣờng nền: khống MS + 7g agar + 20g đƣờng + 0,5 mg/l BAP + 1
mg/l NAA, bổ sung nồng độ 2,4-D thích hợp (kết quả từ thí nghiệm 1) Mẫu cấy: mơ sẹo cĩ diện tích bằng nhau.
Cách thực hiện: mẫu đƣợc cấy vào chai nƣớc biển + bổ sung vào mơi trƣờng thí nghiệm với các nghiệm thức bổ sung 0; 0,5; 1; 1,5 ml dung dịch vi khuẩn. NT1: MTN + 0 ml dung dịch vi khuẩn + dung dịch tăng sinh MMS NT2: MTN + 0,5 ml dung dịch vi khuẩn
NT3: MTN + 1 ml dung dịch vi khuẩn NT4: MTN + 1,5 ml dung dịch vi khuẩn
Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi sự phát triển mơ sẹo sau khi cho nhiễm khuẩn ở các nồng độ khác nhau, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu:
theo dõi sự thay đổi trạng thái và kết cấu mơ sẹo: kích thƣớc, hình dạng, màu sắc.
3.3.3.6 Thí nghiệm 6: “Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20” từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20”
Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái
sinh chồi từ mơ sẹo.
Mơi trƣờng nền: khống MS + 7g agar + 20g đƣờng, bổ sung nồng độ BAP/
NAA thích hợp (kết quả từ thí nghiệm 2) Mẫu cấy: mơ sẹo
Cách thực hiện: mẫu đƣợc cấy vào chai nƣớc biển + bổ sung vào mơi trƣờng
thí nghiệm với các nghiệm thức bổ sung 0; 0,5; 1; 1,5 ml dung dịch vi khuẩn. NT1: MTN + 0 ml dung dịch vi khuẩn + dung dịch tăng sinh MMS NT2: MTN + 0,5 ml dung dịch vi khuẩn
NT3: MTN + 1 ml dung dịch vi khuẩn NT4: MTN + 1,5 ml dung dịch vi khuẩn
Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo ở các nồng độ
nhiễm khuẩn khác nhau, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu: tỷ lệ nảy chồi(%) = (số cây nảy chồi / tổng số cây)*100 số chồi trên mẫu = tổng số chồi / mẫu
3.3.3.7 Thí nghiệm 7 : “Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh rễ từ mơ sẹo của giống lúa VĐ 20” mơ sẹo của giống lúa VĐ 20”
Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh rễ từ mơ sẹo.
Mơi trƣờng nền: khống MS + 7g agar + 20g đƣờng, bổ sung nồng độ NAA
thich hợp (kết quả từ thí nghiệm 4) Mẫu cấy: mơ sẹo
Cách thực hiện: mẫu đƣợc cấy vào chai nƣớc biển + bổ sung vào mơi trƣờng thí nghiệm với các nghiệm thức bổ sung 0; 0,5; 1; 1,5 ml dung dịch vi khuẩn. NT1: MTN + 0 ml dung dịch vi khuẩn + dung dịch tăng sinh MMS NT2: MTN + 0,5 ml dung dịch vi khuẩn
NT3: MTN + 1 ml dung dịch vi khuẩn NT4: MTN + 1,5 ml dung dịch vi khuẩn
Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi khả năng tái sinh rễ từ mơ sẹo ở các nồng độ
nhiễm khuẩn khác nhau. Các chỉ tiêu:
tỷ lệ ra rễ (%) = (số mẫu ra rễ / tổng số mẫu)*100 số rễ trên mẫu = tổng số rễ / mẫu
3.3.3.8 Thí nghiệm 8 : “Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tăng sinh mơ sẹo của giống lúa VĐ 20”
Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh mơ sẹo của giống lúa VĐ20.
Mơi trƣờng nền: khống MS + 7g agar + 20g đƣờng.
Mẫu cấy: mơ sẹo
Cách thực hiện: mẫu đƣợc cấy vào chai nƣớc biển + bổ sung vào mơi trƣờng thí nghiệm với các nghiệm thức bổ sung 0; 0,5; 1; 1,5 ml dung dịch vi khuẩn. NT1: MTN + 0 ml dung dịch vi khuẩn + dung dịch tăng sinh MMS NT2: MTN + 0,5 ml dung dịch vi khuẩn
NT3: MTN + 1 ml dung dịch vi khuẩn NT4: MTN + 1,5 ml dung dịch vi khuẩn
Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi sự phát triển mơ sẹo sau khi cho nhiễm khuẩn ở
các nồng độ khác nhau, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu:
theo dõi sự thay đổi trạng thái và kết cấu mơ sẹo: kích thƣớc, hình dạng, màu sắc.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Thí nghiệm 1: “ Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20” giống lúa VĐ20”
Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D đến kích thƣớc mơ sẹo (cm) sau 4 tuần nuơi cấy
Nghiệm thức
2,4-D (mg/l) BAP (mg/l) NAA (mg/l) Kích thƣớc mơ sẹo (cm) sau 4 tuần
1.1 0 0,5 1 0,91c
1.2 1 0,5 1 0,63a
1.3 2 0,5 1 0,78b
1.4 3 0,5 1 0,71ab
* Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình cĩ kí tự theo sau giống nhau khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05).
0,91 0,63 0,78 0,71 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 Nghiệm thức cm
Sau 4 tuần nuơi cấy, theo bảng 4.1 cho thấy nghiệm thức (1.1) cĩ kích thƣớc mơ sẹo lớn nhất và cĩ sự khác biệt rõ rệt so với các nghiệm thức cịn lại. Sự khác biệt này cĩ ý nghĩa về mặt thống kê sinh học (P<0,05). Bên cạnh đĩ các mẫu mơ sẹo của nghiệm thức (1.1) cĩ mơ phát triển tốt, xốp, mơ sẹo sinh phơi và cĩ xuất hiện chồi, cịn các mẫu mơ sẹo của các nghiệm thức cịn lại tuy cĩ phát triển về kích thƣớc nhƣng mơ sẹo chuyển sang màu vàng nâu và cứng, ít cĩ khả năng tái sinh cây.
Theo tác giả Đồn Thị Phƣơng Thuỳ [6], các dịng lúa khác nhau cĩ các đặc tính di truyền khác nhau vì vậy nhu cầu chất điều hịa tăng trƣởng thực vật cho sự hình thành và tăng trƣởng mơ sẹo là khác nhau. Cĩ lẽ, nồng độ auxin ngoại sinh trong nghiệm thức (1.1) là thích hợp, khơng cần bổ sung thêm 2,4-D vào mơi trƣờng, mơ sẹo của giống lúa VĐ20 vẫn tăng trƣởng và phát triển tốt hơn so với các nghiệm thức khác.
Qua bảng 4.1, nghiệm thức (1.1) cho kết quả tốt nhất, do đĩ nghiệm thức này đƣợc chọn sử dụng cho thí nghiệm 4.
Hình 4.1: Mơ sẹo trên mơi trƣờng MS bổ sung 0,5mg/l BAP và 1mg/l NAA sau 5 tuần nuơi cấy (1.1)
Hình 4.2: Các mơ sẹo ở thí nghiệm 1 sau 5 tuần nuơi cấy
4.2 Thí nghiệm 2: “ Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA đến khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20”
Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA đến tỷ lệ tái sinh chồi từ mơ sẹo
Nghiệm thức BAP (mg/l) NAA (mg/l)
Tỷ lệ tái sinh chồi (%) 2 tuần 3 tuần 2.1 1 0,1 41,66ab 58,33ab 2.2 1 0,5 50ab 66,66ab 2.3 1 1 58,33ab 58,33ab 2.4 2 0,1 33,33a 33,33a 2.5 2 0,5 33,33a 50,33ab 2.6 2 1 66,66b 75b
* Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình cĩ kí tự theo sau giống nhau khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05).
1 cm
0 10 20 30 40 50 60 70 80 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 Nghiệm thức Tỷ lệ (%) tuần 2 tuần 3
Đồ thị 4.2: Tỷ lệ tái sinh chồi ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian
Nhìn chung tỷ lệ tái sinh chồi khá cao. Theo kết quả thống kê, tỷ lệ tái sinh chồi của các nghiệm thức đều tăng chỉ cĩ ở 2 nghiệm thức (2.3) và (2.4) là khơng tăng, và nghiệm thức (2.6) cĩ tỷ lệ tái sinh cao nhất. Sự khác biệt này khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống kê (P>0,05). Từ kết quả bảng cho thấy, tỷ lệ nồng độ giữa BAP và NAA quá cao sẽ gây ức chế sự tái sinh chồi, nhƣ nghiệm thức (2.4) mơ sẹo khơng những tái sinh chồi ít mà một số mẫu bị đen khơng phát triển, do đĩ việc kết hợp thích hợp tỷ lệ nồng độ BAP và NAA sẽ giúp mơ sẹo tái sinh tốt.
Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA đến số chồi hình thành từ mơ sẹo Nghiệm thức BAP (mg/l) NAA (mg/l)
Số chồi trên mẫu 2 tuần 3 tuần 2.1 1 0,1 1.16ab 1,33ab 2.2 1 0,5 1,75ab 2,08b 2.3 1 1 1,91b 2,41b 2.4 2 0,1 0,66a 0,66a 2.5 2 0,5 1,66ab 2,16b 2.6 2 1 1,91b 2,5b
* Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình cĩ kí tự theo sau giống nhau khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05).
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 Nghiệm thức S ố ch ồi tuần 2 tuần 3
Đồ thị 4.3: Số chồi hình thành trên mẫu ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian
Số chồi hình thành ở mỗi nghiệm thức đều tăng theo thời gian. chỉ cĩ nghiệm thức (2.4) số chồi hình thành rất ít và khơng tăng (2,66). Ở nghiệm thức (2.3) mặc dù tỷ lệ tái sinh ở tuần thứ 3 khơng tăng so với tuần thứ 2 (bảng 4.2), nhƣng số chồi lại tăng rõ rệt, cĩ thể ở tỷ lệ nồng độ này ức chế sự tái sinh chồi nhƣng khơng ảnh hƣởng đến sự hình thành và phát triển của mẫu đã tái sinh. Sau 3 tuần, ở các nghiệm thức (2.2); (2.3); (2.5), (2.6) số chồi hình thành cĩ sự khác biệt so với các nghiệm thức cịn lại và so với tuần thứ 2. Sự khác biệt này khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống kê sinh học (P>0,05). Tỷ lệ Cyt/Aux cĩ ảnh hƣởng rất quan trọng, nĩ quyết định chiều hƣớng phát sinh hình thái của mơ nuơi cấy [6], do đĩ với tỷ lệ Cyt/Aux trong mơi trƣờng thích hợp sẽ kích thích sự tạo chồi của mơ sẹo. Điều này phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đây: hoạt động của một chất điều hồ tăng trƣởng phụ thuộc vào:
- Sự cân bằng giữa các chất điều hồ tăng trƣởng thực vật trong mơ đích.