Ánh sáng: Nhu cầu ánh sáng cho sự hình thành và tăng trƣởng của mơ sẹo tuỳ thuộc vào lồi thực vật. Ở một số lồi, mơ sẹo thƣờng đƣợc cảm ứng và tăng trƣởng trong điều kiện tối tuy nhiên một số lồi sự cảm ứng và tăng trƣởng của mơ
sẹo địi hỏi điều kiện ánh sáng hoặc quang kỳ thích hợp [55]. Hiệu ứng ánh sáng với chiều hƣớng tăng trƣởng và biệt hĩa tế bào trong nuối cấy
tế bào in vitro khơng chỉ phụ thuộc vào kiểu gen của vật liệu nuơi cấy mà cịn phụ thuộc vào bƣớc sĩng, cƣờng độ, thời gian chiếu sáng và giai đoạn tăng trƣởng của tế bào nuơi cấy [33].
Nhiệt độ: Hầu hết các mơ và tế bào đều tăng trƣởng tốt ở điều kiện nhiệt độ khoảng 26-30o
C [43]. Tuy nhiên, hiệu ứng nhiệt độ cũng thay đổi tùy lồi thực vật
2.3.3.3 Ảnh hƣởng của chất điều hồ tăng trƣởng thực vật
Chất điều hịa tăng trưởng thực vật là thuật ngữ đƣợc dùng để chỉ tổng quát những hợp chất hữu cơ cĩ tác động làm biến đổi một quá trình sinh lý nào đĩ của thực vật ở nồng độ rất thấp. Chúng khơng phải là chất dinh dƣỡng hay là nguyên tố khống cần thiết cho sự tăng trƣởng của thực vật [11].
Kích thích tố thực vật (phytohormone) là thuật ngữ đƣợc dùng để chỉ những hợp chất thiên nhiên do thực vật tạo ra với hàm lƣợng rất thấp từ vị trí sản xuất di chuyển đến vị trí hoạt động: ở đây, chúng tác động làm biến đổi một quá trình sinh lý nào đĩ của thực vật [11].
Để cĩ hoạt tính, các chất điều hịa tăng trƣởng thực vật phải cố định trên một thể nhận chuyên biệt của tế bào đích, thể nhận này cĩ thể thay đổi theo mơ đích, nên một chất điều hịa tăng trƣởng thực vật cĩ hiệu ứng khác nhau trên những mơ đích khác nhau. Nhìn chung, hoạt động của các chất điều hịa tăng trƣởng thực vật phụ thuộc vào các yếu tố sau:
- Bản chất và nồng độ của các chất điều hịa tăng trƣởng thực vật.
- Sự cân bằng giữa các chất điều hịa tăng trƣởng thực vật trong mơ đích. - Loại mơ đích và trạng thái sinh lý của mơ đích [3]
2.4. Ảnh hƣởng của vi sinh vật lên sự phát triển của thực vật
Giữa thực vật và vi sinh vật cĩ mối quan hệ mật thiết với nhau, bên cạnh một số vi sinh vật cĩ hại thì một số khác cĩ lợi cho cây trồng giúp cây dễ hấp thu, cĩ khả năng tổng hợp các hormone tăng trƣởng thực vật và các chất tạo tính kháng với các tác nhân gây bệnh. Dựa vào những đặc điểm cĩ lợi đĩ ngƣời ta áp dụng các kỹ thuật sinh học tạo ra các loại phân bĩn, thuốc trừ sâu sinh học thay thế cho phân bĩn, thuốc trừ sâu hĩa học gây độc cho ngƣời và động vật. Ví dụ nhƣ:
- Azobacterin là loại vi khuẩn cố định đạm, cĩ khả năng cung cấp một lƣợng lớn chất auxin, giberelin do đĩ để tăng năng suất cây trồng trong đĩ cĩ cây lúa, ngƣời ta sản xuất hàng loạt các vi khuẩn này để sản xuất phân bĩn cho đất màu mỡ gọi là phân sinh học Azotobacterin [4].
- Nấm Trichoderma là nấm hiện diện trên nhiều thực vật và là chủng nấm cĩ lợi, khi xử lý trên ruộng lúa thì khơng những gia tăng năng suất lúa mà cịn gia tăng khả năng kháng bệnh của cây lúa [10].
- Baculovirus gây nhiễm cho hơn 600 lồi cơn trùng khác nhau, vấn đề quan trọng là nĩ khơng gây nhiễm cho ngƣời, động vật và cả thực vật. Baculovirus cĩ tiềm năng nhƣ là tác nhân kiểm sốt sinh học đối với vật làm hại cơn trùng. Song thị trƣờng áp dụng cịn nhiều hạn chế, do đĩ địi hỏi phải cĩ nhiều hiểu biết hơn nữa để kiểm sốt sự biểu hiện gene của Baculovirus hy vọng mang đến nhiều lợi ích cho sản xuất vaccin và thuốc trừ sâu sinh học [4].
* Trong nuơi cấy mơ tế bào, điều kiện vơ trùng phải đƣợc đảm bảo tuyệt đối,
và chíng điều kiện vơ trùng đã loại bỏ các mối tƣơng tác cĩ ích giữa thực vật và vi sinh vật. Cĩ rất nhiều nghiên cứu đã đƣợc tiến hành nhằm mục tiêu chọn lọc những chủng vi khuẩn cĩ tác động tốt tới sự phát triển của cây in vitro, cải thiện phẩm chất, phát triển khả năng trong chọn lọc giống cây trồng. Một vài nghiên cứu gần đây đã đề cập đến tác động của vi khuẩn Methylobacterrium sp. lên nhiều loại cây trồng.
2.5. Đặc điểm của chi Methylobacterium 2.5.1 Lịch sử phát hiện và phân loại 2.5.1 Lịch sử phát hiện và phân loại
Chi Methylobacterium bao gồm nhiều lồi vi khuẩn cĩ sắc tố hồng dinh dƣỡng methyl tùy ý (pink- pigmented facultative methlotrophs, PPFM) [24], [53]. Chúng cĩ khả năng sử dụng các hợp chất chỉ chứa một nguyên tử carbon nhƣ formaldehyde, methanol hay các hợp chất chứa nhiều nguyên tử carbon làm nguồn cung cấp năng lƣợng và carbon cho quá trình sinh trƣởng [44]. Đa số các lồi đều cĩ khả năng phát triển trên mơi trƣờng nutrient agar, một số lồi cĩ khả năng tăng trƣởng trên mơi trƣờng cĩ bổ sung methylamine và chỉ cĩ một lồi cĩ khả năng sử dụng methan [34].
Lồi Methylobacterium đƣợc phân lập và mơ tả lần đầu tiên vào năm 1913 do Bassalik phân lập từ giun đất và đƣợc đặt tên là Bacillus extorquens. Mặc dù vi
khuẩn PPFM hiện diện rất phổ biến trong đất hay trên các sinh vật nhƣng trong một thời gian dài các vi khuẩn này khơng đƣợc phân lập và nghiên cứu nhiều. Vào những năm 1960, 1970 khi nghiên cứu tập trung vào con đƣờng đồng hĩa các hợp chất một cacbon thì nhĩm vi khuẩn dinh dƣỡng methyl đƣợc phân lập và nghiên cứu, trong đĩ tập trung vào các phƣơng thức biến dƣỡng năng lƣợng và những ứng dụng của nhĩm vi khuẩn này [34].
Năm 1974, Patt và các cộng sự phân lập đƣợc lồi vi khuẩn PPFM đầu tiên cĩ khả năng sử dụng methan. Lồi này sắp xếp vào một chi mới là
Methylobacterium với tên lồi là Methylobacterium organophilum. Năm 1982, Green và Bousfield nhận thấy chủng Methylobacterium organophilum cĩ nhiều đặc điểm rất giống các lồi vi khuẩn PPFM đã đƣợc cơng bố trƣớc đây. Khi so sánh 140 đặc điểm sinh lý, sinh hĩa và hình thái của 149 chủng vi khuẩn PPFM với lịai M. organophilum cho thấy chúng tƣơng đồng hơn 70%. Do vậy, Green và Bousfield đã đề nghị sắp xếp các lồi vi khuẩn PPFM vào chi Methylobacterium
[34].
Từ năm 1992 đến năm 2005 đã cĩ thêm 15 lồi Methylobacterium sp. mới phân lập và đặt tên. Trong đĩ, các lồi mới đƣợc xác định nhờ vào các đặc điểm sinh lý, sinh hĩa khác biệt và sự tƣơng đồng của trình tự rRNA giữa các lồi khác nhau [29], [48], [62]. Vị trí phân loại chi Mehtylobacterium trong giới vi sinh vật nhƣ sau: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacterium Lớp: Alphaproteobacteria Bộ: Rhizobiales Họ: Methylobacteriaceae
2.5.2 Đặc điểm sinh thái
Vi khuẩn Methylobacterium phân bố rộng rãi trong tự nhiên, chúng hiện diện trong nhiều mơi trƣờng khác nhau bao gồm: đất, đất bùn ao hồ, nƣớc sạch, nƣớc mƣa, khơng khí, bề mặt lá cây, nốt sần ở rễ thực vật, các loại hạt giống…[23], [29].
PPFM phân bố rộng rãi trên nhiều lồi cây, chúng đƣợc phân lập từ hơn 100 lồi thực vật từ địa tiền, rêu cho đến các lồi cây hạt trần và cây hạt kín [26]. Vi khuẩn PPFM là những vi khuẩn hiếu khí hồn tồn, do vậy các vi khuẩn này thƣờng đƣợc phân lập từ bất kỳ mơi trƣờng nƣớc sạch nào cĩ chứa oxy hịa tan. Ngồi ra, vi khuẩn PPFM cịn cĩ khả năng kháng với ion Cl- nên chúng vẫn hiện diện trong nƣớc sạch dùng trong sinh hoạt [32], [33]. Vi khuẩn PPFM thƣờng lan truyền qua khơng khí và cĩ khả năng thực hiện nhiều quá trình trao đổi chất khác nhau, trong một số điều kiện thuận lợi nhất định vi khuẩn PPFM cĩ khả năng lên men tạo ra các sản phẩm khác nhau. Do vậy, các vi khuẩn PPFM đang đƣợc sử dụng các sản phẩm cĩ giá trị sinh học, chẳng hạn nhƣ các hợp chất polyme sinh học [27], [34].
Hình 2.3: Methylobacterium sp. trên cây rêu (A), hình dạng tế bào vi khuẩn chụp qua kính hiển vi điện tử (B) [36]
2.5.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hố
Hầu hết các lồi vi khuẩn Methylobacterium sp. thƣờng cĩ hình que (0,8-1,0 x 1,0-0,8 μM). Vi khuẩn thƣờng nằm ở dạng tế bào đơn hay đơi hay đơi khi kết lại theo dạng hoa hồng (rosettes) [9].
Hình 2.4: Methylobacterium sp. chủng BJ001 nuơi cấy trên mơi trƣờng thạch LB (A) vào mơi trƣờng dịch thể LB (B) chụp qua kính hiển vi điện tử quét [22]
Đa số các chủng đều cĩ khả năng di động nhờ một tiêm mao ở cực hay gần cực, tuy nhiên một vài lồi lại khơng cĩ khả năng di động. Đa số các lồi vi khuẩn
Methylobacterium sp. là vi khuẩn Gram âm, một số cĩ Gram biến đổi. Vi khuẩn thƣờng tăng trƣởng chậm, khuẩn lạc thƣờng cĩ màu hồng đậm hay đỏ cam sáng, một số chủng khơng tăng trƣởng đƣợc trên mơi trƣờng nutrient agar. Sắc tố hồng của vi khuẩn khơng tan trong nƣớc, khơng phát sáng huỳnh quang và là hợp chất carotenoid, hấp thu bƣớc sĩng cực đại ở 473, 499 và 532 nm [29], [34].
Ở mơi trƣờng lỏng nuơi cấy tĩnh vi khuẩn tạo thành một lớp màng mỏng trên bề mặt, điều này cho thấy hầu hết các chủng là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Oxidase dƣơng tính yếu, catalase dƣơng tính hay âm tính tuỳ thuộc vào lồi vi khuẩn. Methylobacterium sp. là những vi khuẩn hố dị dƣỡng, cĩ khả năng sử dụng tùy ý các hợp chất methyl. Do vậy, tất cả các lồi đều cĩ khả năng tăng trƣởng trên mơi trƣờng cĩ bổ sung formaldehyde (ở nồng độ thấp), formate và methanol, một vài lồi cĩ khả năng sử dụng các hợp chất methylamine, chỉ cĩ một
lồi duy nhất là M. organophilum cĩ khả năng sử dụng methane làm nguồn cung cấp carbon và năng lƣợng [29], [34].
Nhiệt độ thích hợp dao động từ 25 đến 30oC, một số lồi vẫn cĩ thể sinh trƣởng ở nhiệt độ 37o
C hay 51oC. Đa số các lồi đều tăng trƣởng ở pH trung tính, một số lồi phát triển ở pH=4, pH=10.
Hầu hết các lồi đều nhạy cảm với các hợp chất kháng sinh nhƣ: kanamycin, gentamycin, streptomycin và tetracylin, trong đĩ chất kháng sinh tetracylin cĩ hoạt tính ức chế mạnh đối với vi khuẩn Methylobacterium sp. [34].
2.5.4 Các ứng dụng của vi khuẩn Methylobacterium sp. 2.5.4.1 Tƣơng tác với thực vật 2.5.4.1 Tƣơng tác với thực vật
Giữa cây và vi khuẩn cĩ quan hệ tƣơng hỗ, một số vi khuẩn cĩ lợi cho cây trồng vì chúng tham gia vào các chu trình sinh địa hố, cung cấp cho cây các chất dinh dƣỡng cần thiết. Vi khuẩn dinh dƣỡng methyl chiếm tỷ lệ lớn trong hệ vi sinh vùng lá của nhiều lồi cây. Kalyaeva và cộng sự (2000, 2003) phát hiện việc gây nhiễm vi khuẩn Methylovorus mays và Methylomonas methanica vào mơi trƣờng nuơi cấy invitro tạo mối liên kết bền vững giữa vi khuẩn và mơ thực vật [39], [40]. Thuốc lá, cây lanh và khoai tây khi nhiễm vi khuẩn tăng trƣởng mạnh hơn so với đối chứng (số chồi tăng, rễ phát triển mạnh), ngay cả trên mơi trƣờng khơng cĩ vitamine [35].
Hình 2.5: Sự tái sinh chồi của lồi cây thuốc lá chuyển gen ipt trên mơi trƣờng MS khơng bổ sung hormone sau một tháng nuơi cấy. (a): khơng bổ sung vi khuẩn Methylovorus mays. (b): cĩ bổ sung vi khuẩn Methylovorus mays [39]
Theo Maliti (2000), so với các vi khuẩn liên kết với thực vật khác thì vi khuẩn Methylobacterium sp. là lồi tồn tại lâu dài và chiếm tỉ lệ lớn nhất khi bề mặt lá đƣợc rửa sạch [46]. Holland và cộng sự (1994) đã đề cập đến việc khử trùng thơng thƣờng trong khâu chuẩn bị nuơi cấy mơ khơng loại trừ đƣợc
Methylobacterium sp., dù đã xử lý với hypochlorite và cồn nhƣng các mơ sẹo phát sinh từ mẫu cấy này vẫn cĩ nguy cơ bị nhiễm PPFM [35]. Đây là nhĩm vi khuẩn rất phong phú và khơng gây bệnh thực vật. PPFM chiếm tỷ lệ lớn và cĩ mật độ từ 104 đến 107 đơn vị khuẩn lạc (cfu) trên mỗi gram trọng lƣợng tƣơi của mơ thực vật [35]. Chúng lây nhiễm qua hạt [26], ở hạt đậu nành khơ mật độ là 105 cfu/gram [35].
Tuy PPFM khơng tăng trƣởng nhanh nhƣ các vi khuẩn vùng lá khác trên mơi trƣờng giàu dinh dƣỡng nhƣng chúng vẫn cĩ khả năng cạnh tranh tạo khuẩn lạc trên lá. Một số tác giả cho rằng dinh dƣỡng methyl tuỳ ý ở PPFM là một phần lý do duy trì mối quan hệ giữa chúng với thực vật. Bằng cách sử dụng nguồn thức ăn khác thƣờng là methanol, PPFM cĩ thể loại bỏ chất độc này khỏi mơ thực vật
và cĩ đƣợc chỗ cƣ ngụ trong lá (mơi trƣờng chỉ thích hợp với một vài lồi vi khuẩn) [44], [50].
Bên cạnh tính phổ biến và tồn tại lâu dài, cịn nhiều bằng chứng cho thấy mặc dù PPFM thu nhận chất dinh dƣỡng từ cây chủ nhƣng khơng phải là mối quan hệ một chiều. Các vi khuẩn này sử dụng nguồn carbon và khống chất từ cây, đồng thời tham gia vào các quá trình sinh hố và chuyển hố quan trọng ở cây chủ.
Methylobacterium sp. nổi bật vì nhiều đặc tính quan trọng nhƣ khả năng tổng hợp amino acid, PHB (Poly- -Hydrobutyrate); tổng hợp carotenoid, tăng cƣờng tạo hƣơng vị ở dâu tây; tăng khả năng nảy mầm của hạt; khả năng phân hủy các hợp chất 2,4,6-trinitrotoluene, nitramine…; khả năng phân hủy và chuyển hĩa một số cơ chất khơng cần thiết ở thực vật thành sản phẩm cĩ giá trị [35].
Chủng PPFM đầu tiên đƣợc Basile và cộng sự (1969) phát hiện kích thích sinh trƣởng ở cây địa tiền (Scapania nemorosa) trong điều kiện in vitro [9].
Kalyaeva và cộng sự (2000, 2003) phát hiện việc nhiễm vi khuẩn
Methylovorus mays và Methylomonas methanica vào mơi trƣờng nuơi cấy in vitro
tạo mối liên kết bền vững giữa vi khuẩn và mơ thực vật. Thuốc lá, cây lanh và khoai tây khi nhiễm khuẩn tăng trƣởng mạnh hơn (số chồi tăng, rễ phát triển mạnh) [39], [40].
Năm 1994, Holland và cộng sự cơng bố về khả năng tƣơng tác của vi khuẩn
Methylobacterium sp. và cây đậu nành trong việc chuyển hố nickel [35].
Cây lúa (Oryza sativa) cũng là một loại cây cĩ mối quan hệ mật thiết với các vi khuẩn PPFM. Nhiều nhà nghiên cứu cũng đã chứng tỏ vi khuẩn
Methylobacterium sp. cĩ tác động tích cực lên sự sinh trƣởng và phát triển của cây lúa cả trong điều kiện in vitro lẫn in vivo.
Maliti (2000) nghiên cứu, đánh giá ảnh hƣởng của một số chủng
Methylobacterium sp. đối với sự tăng trƣởng và phát triển của cây lúa ở 3 mức độ: nuơi cấy mơ, cây con trong điều kiện in vitro và cây trƣởng thành trong mơi trƣờng nhà kính. Kết quả cho thấy: vi khuẩn Methylobacterium sp. cĩ khả năng
làm gia tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt, tăng trọng lƣợng tƣơi, chiều cao cây mạ trong điều kiện in vitro [46].
Năm 2004, Madhaiyan và cộng sự cũng đã tiến hành các thí nghiệm gây nhiễm PPFM lên hạt lúa hay phun lên lá và kết quả cho thấy: vi khuẩn
Methylobacterium sp. cĩ hoạt tính kích thích tăng trƣởng, gia tăng khả năng đẻ nhánh của lúa gĩp phần gia tăng năng suất lúa từ 22,1 đến 24,1%. Ngồi ra, các vi khuẩn Methylobacterium sp. cịn cĩ vai trị ức chế các chủng vi khuẩn gây bệnh trên cây lúa, gĩp phần làm giảm tỷ lệ cây bệnh từ 17,8-23,7%. Cơng trình của Madhaiyan và cộng sự (2004) cũng đã chứng tỏ mối tƣơng quan giữa khả năng kháng bệnh của cây lúa khi xử lý với vi khuẩn Methylobactreium sp. và sự gia tăng polyphenol oxidase trong cây [47].
Qua các kết quả khảo sát về ảnh hƣởng của vi khuẩn Methylobactreium sp. lên sự hình thành mơ sẹo ở cây thuốc lá và cây cúc cho thấy: vi khuẩn cĩ ảnh hƣởng khác nhau lên quá trình hình thành mơ sẹo ở các loại mơ hay các loại cây nuơi cấy. Đối với Chrysanthenum sp. vi khuẩn hạn chế sự hình thành mơ sẹo nhƣng kích thích sự hình thành phơi ở các mơ sẹo này, trong khi đĩ ở Nicotiana tabacum vi khuẩn lại ức chế quá trình hình thành mơ sẹo ở mơ phiến lá và mơ lĩng thân. Nhƣ vậy, vi khuẩn Methylobacterium sp. cĩ khả năng tác động lên quá trình biệt hĩa cơ quan ở thực vật. Ngồi vai trị tác động của vi khuẩn thì bản chất của mơ và lồi thực vật cũng quyết định đến khả năng và chiều hƣớng phát sinh cơ quan của nuơi cấy invitro. Bên cạnh đĩ các kết quả thí nghiệm cịn cho thấy rằng vi khuẩn Methylobacterium sp. cịn cĩ khả năng tăng cƣờng quá trình hình thành