2.5.4.1 Tƣơng tác với thực vật
Giữa cây và vi khuẩn cĩ quan hệ tƣơng hỗ, một số vi khuẩn cĩ lợi cho cây trồng vì chúng tham gia vào các chu trình sinh địa hố, cung cấp cho cây các chất dinh dƣỡng cần thiết. Vi khuẩn dinh dƣỡng methyl chiếm tỷ lệ lớn trong hệ vi sinh vùng lá của nhiều lồi cây. Kalyaeva và cộng sự (2000, 2003) phát hiện việc gây nhiễm vi khuẩn Methylovorus mays và Methylomonas methanica vào mơi trƣờng nuơi cấy invitro tạo mối liên kết bền vững giữa vi khuẩn và mơ thực vật [39], [40]. Thuốc lá, cây lanh và khoai tây khi nhiễm vi khuẩn tăng trƣởng mạnh hơn so với đối chứng (số chồi tăng, rễ phát triển mạnh), ngay cả trên mơi trƣờng khơng cĩ vitamine [35].
Hình 2.5: Sự tái sinh chồi của lồi cây thuốc lá chuyển gen ipt trên mơi trƣờng MS khơng bổ sung hormone sau một tháng nuơi cấy. (a): khơng bổ sung vi khuẩn Methylovorus mays. (b): cĩ bổ sung vi khuẩn Methylovorus mays [39]
Theo Maliti (2000), so với các vi khuẩn liên kết với thực vật khác thì vi khuẩn Methylobacterium sp. là lồi tồn tại lâu dài và chiếm tỉ lệ lớn nhất khi bề mặt lá đƣợc rửa sạch [46]. Holland và cộng sự (1994) đã đề cập đến việc khử trùng thơng thƣờng trong khâu chuẩn bị nuơi cấy mơ khơng loại trừ đƣợc
Methylobacterium sp., dù đã xử lý với hypochlorite và cồn nhƣng các mơ sẹo phát sinh từ mẫu cấy này vẫn cĩ nguy cơ bị nhiễm PPFM [35]. Đây là nhĩm vi khuẩn rất phong phú và khơng gây bệnh thực vật. PPFM chiếm tỷ lệ lớn và cĩ mật độ từ 104 đến 107 đơn vị khuẩn lạc (cfu) trên mỗi gram trọng lƣợng tƣơi của mơ thực vật [35]. Chúng lây nhiễm qua hạt [26], ở hạt đậu nành khơ mật độ là 105 cfu/gram [35].
Tuy PPFM khơng tăng trƣởng nhanh nhƣ các vi khuẩn vùng lá khác trên mơi trƣờng giàu dinh dƣỡng nhƣng chúng vẫn cĩ khả năng cạnh tranh tạo khuẩn lạc trên lá. Một số tác giả cho rằng dinh dƣỡng methyl tuỳ ý ở PPFM là một phần lý do duy trì mối quan hệ giữa chúng với thực vật. Bằng cách sử dụng nguồn thức ăn khác thƣờng là methanol, PPFM cĩ thể loại bỏ chất độc này khỏi mơ thực vật
và cĩ đƣợc chỗ cƣ ngụ trong lá (mơi trƣờng chỉ thích hợp với một vài lồi vi khuẩn) [44], [50].
Bên cạnh tính phổ biến và tồn tại lâu dài, cịn nhiều bằng chứng cho thấy mặc dù PPFM thu nhận chất dinh dƣỡng từ cây chủ nhƣng khơng phải là mối quan hệ một chiều. Các vi khuẩn này sử dụng nguồn carbon và khống chất từ cây, đồng thời tham gia vào các quá trình sinh hố và chuyển hố quan trọng ở cây chủ.
Methylobacterium sp. nổi bật vì nhiều đặc tính quan trọng nhƣ khả năng tổng hợp amino acid, PHB (Poly- -Hydrobutyrate); tổng hợp carotenoid, tăng cƣờng tạo hƣơng vị ở dâu tây; tăng khả năng nảy mầm của hạt; khả năng phân hủy các hợp chất 2,4,6-trinitrotoluene, nitramine…; khả năng phân hủy và chuyển hĩa một số cơ chất khơng cần thiết ở thực vật thành sản phẩm cĩ giá trị [35].
Chủng PPFM đầu tiên đƣợc Basile và cộng sự (1969) phát hiện kích thích sinh trƣởng ở cây địa tiền (Scapania nemorosa) trong điều kiện in vitro [9].
Kalyaeva và cộng sự (2000, 2003) phát hiện việc nhiễm vi khuẩn
Methylovorus mays và Methylomonas methanica vào mơi trƣờng nuơi cấy in vitro
tạo mối liên kết bền vững giữa vi khuẩn và mơ thực vật. Thuốc lá, cây lanh và khoai tây khi nhiễm khuẩn tăng trƣởng mạnh hơn (số chồi tăng, rễ phát triển mạnh) [39], [40].
Năm 1994, Holland và cộng sự cơng bố về khả năng tƣơng tác của vi khuẩn
Methylobacterium sp. và cây đậu nành trong việc chuyển hố nickel [35].
Cây lúa (Oryza sativa) cũng là một loại cây cĩ mối quan hệ mật thiết với các vi khuẩn PPFM. Nhiều nhà nghiên cứu cũng đã chứng tỏ vi khuẩn
Methylobacterium sp. cĩ tác động tích cực lên sự sinh trƣởng và phát triển của cây lúa cả trong điều kiện in vitro lẫn in vivo.
Maliti (2000) nghiên cứu, đánh giá ảnh hƣởng của một số chủng
Methylobacterium sp. đối với sự tăng trƣởng và phát triển của cây lúa ở 3 mức độ: nuơi cấy mơ, cây con trong điều kiện in vitro và cây trƣởng thành trong mơi trƣờng nhà kính. Kết quả cho thấy: vi khuẩn Methylobacterium sp. cĩ khả năng
làm gia tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt, tăng trọng lƣợng tƣơi, chiều cao cây mạ trong điều kiện in vitro [46].
Năm 2004, Madhaiyan và cộng sự cũng đã tiến hành các thí nghiệm gây nhiễm PPFM lên hạt lúa hay phun lên lá và kết quả cho thấy: vi khuẩn
Methylobacterium sp. cĩ hoạt tính kích thích tăng trƣởng, gia tăng khả năng đẻ nhánh của lúa gĩp phần gia tăng năng suất lúa từ 22,1 đến 24,1%. Ngồi ra, các vi khuẩn Methylobacterium sp. cịn cĩ vai trị ức chế các chủng vi khuẩn gây bệnh trên cây lúa, gĩp phần làm giảm tỷ lệ cây bệnh từ 17,8-23,7%. Cơng trình của Madhaiyan và cộng sự (2004) cũng đã chứng tỏ mối tƣơng quan giữa khả năng kháng bệnh của cây lúa khi xử lý với vi khuẩn Methylobactreium sp. và sự gia tăng polyphenol oxidase trong cây [47].
Qua các kết quả khảo sát về ảnh hƣởng của vi khuẩn Methylobactreium sp. lên sự hình thành mơ sẹo ở cây thuốc lá và cây cúc cho thấy: vi khuẩn cĩ ảnh hƣởng khác nhau lên quá trình hình thành mơ sẹo ở các loại mơ hay các loại cây nuơi cấy. Đối với Chrysanthenum sp. vi khuẩn hạn chế sự hình thành mơ sẹo nhƣng kích thích sự hình thành phơi ở các mơ sẹo này, trong khi đĩ ở Nicotiana tabacum vi khuẩn lại ức chế quá trình hình thành mơ sẹo ở mơ phiến lá và mơ lĩng thân. Nhƣ vậy, vi khuẩn Methylobacterium sp. cĩ khả năng tác động lên quá trình biệt hĩa cơ quan ở thực vật. Ngồi vai trị tác động của vi khuẩn thì bản chất của mơ và lồi thực vật cũng quyết định đến khả năng và chiều hƣớng phát sinh cơ quan của nuơi cấy invitro. Bên cạnh đĩ các kết quả thí nghiệm cịn cho thấy rằng vi khuẩn Methylobacterium sp. cịn cĩ khả năng tăng cƣờng quá trình hình thành rễ ở P. fortunei và Chrysanthemum sp., so với đối chứng ở nghiệm thức cĩ bổ sung vi khuẩn mẫu cấy thành lập rễ sớm hơn, nhiều hơn [9].
Ngồi PPFM, cịn cĩ những nghiên cứu sử dụng các lồi vi khuẩn cĩ lợi khác nhƣ khảo sát sự tăng trƣởng và phát triển của cây hoa Cúc, cây hoa Bi Bi và cây Địa Lan cĩ sự hiện diện của Bacillus spp. trong nuơi cấy in vitro [5] cho kết quả: tuỳ theo từng loại cây mà Bacillus spp. cĩ tác dụng khác nhau nhƣ tăng chiều cao, số lƣợng rễ, trọng lƣợng tƣơi. Vi khuẩn Methanotropic cĩ ảnh hƣởng đến sự
hình thành callus của hạt lúa mì, gia tăng sự tạo rễ, đồng thời gia tăng sự tái sinh cây [40]. Với sự hiện diện của vi khuẩn Methylovorus mays trên mơi trƣờng nuơi cấy làm tăng khả năng tái sinh chồi của cây thuốc lá chuyển gen ipt [39]. Từ những kết quả này chứng tỏ giữa thực vật và vi sinh vật cĩ mối quan hệ tƣơng hỗ cĩ lợi tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển và tăng trƣởng của thực vật trong điều kiện in vitro và in vivo.
2.5.4.2 Sinh tổng hợp auxin và cytokinin
Khơng chỉ cĩ thực vật mà vi sinh vật cũng cĩ thể tổng hợp auxin và cytokinin, đối với các vi khuẩn cĩ lợi và vi khuẩn tƣơng tác với thực vật thì đây cĩ thể là nguyên nhân kích thích cây phát triển.
Omer và cộng sự (2004) đã khảo sát sự hiện diện của IAA trong mơi trƣờng chứa dịch nổi của PPFM bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp kết hợp với phân tích phổ NMR (Nuclear Mangnetic Radiation: cộng hƣởng từ hạt nhân) đã chứng tỏ vi khuẩn PPFM cĩ khả năng tổng hợp hormone thực vật là IAA [50].
Holland và cộng sự (1994) kiểm tra mối quan hệ giữa PPFM, cytokinin và sự phát triển của thực vật đã cho thấy PPFM cĩ ảnh hƣởng đến lƣợng cytokinin cĩ trong mơ tế bào thực vật [35].
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian : từ tháng 3/2006 đến tháng 7/2006
Địa điểm : phịng thí nghiệm sinh học phân tử - khoa Sinh học - trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên.
3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu
Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên giống lúa VĐ20 đƣợc cung cấp từ Cơng ty cổ phần giống cây trồng Miền Nam.
* Đặc tính nơng học
Giống lúa VĐ 20: là giống lúa cao sản ngắn ngày, thời gian sinh trƣởng 95- 100 ngày, cây cao 85- 90 cm, năng suất 6- 8 tấn/ ha. Dạng hình khá, bơng to, ít lép, chín sớm, nhiễm bệnh vàng lá, chịu phèn trung bình. Hạt gạo thon dài, khơng bạc bụng, cơm thơm dẻo (Cơng ty cổ phần giống cây trồng Miền Nam).
(a) (b)
Hình 3.1: Giống lúa VĐ20: (a) hạt chƣa bĩc vỏ trấu, (b) hạt bĩc vỏ trấu
Chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. 1019 do phịng thí nghiệm sinh học phân tử - khoa Sinh học - trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên phân lập cung cấp. * Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hĩa của chủng 1019 [9]
Đặc điểm hình thái, sinh lý
Chủng 1019 là những vi khuẩn cĩ màu hồng, hình que ngắn, cĩ khả năng di động, Gram âm, nhiệt độ tăng trƣởng thích hợp từ 25-35oC
Đặc điểm Chủng 1019
Màu sắc khuẩn lạc trên MMS Hồng nhạt
Đƣờng kính khuẩn lạc 2-3 mm
Hình dạng khuẩn lạc Trịn, lồi, nhầy, cĩ viền trắng bên ngồi Kích thƣớc tế bào 2-4 x 4-6 m Khả năng di động Cĩ Gram - pH thích hợp 5,8 ± 1 Nhiệt độ 25-35oC
Hình dạng tế bào Dấu phẩy, phình to ở hai đầu
Trong giới hạn nồng độ các chất điều hịa tăng trƣởng thực vật thƣờng sử dụng trong mơi trƣờng nuơi cấy mơ tế bào thực vật, thì nồng độ các chất điều hồ tăng trƣởng thực vật khơng ảnh hƣởng tới sự phát triển của chủng 1019, do vậy việc bổ sung hormone vào mơi trƣờng nuơi cấy thực vật sẽ khơng ảnh hƣởng đến sự tăng trƣởng của vi khuẩn.
Chủng 1019 tăng trƣởng tối đa sau 30 giờ nuơi cấy do đĩ thời gian thích hợp để thu nhận sinh khối tế bào là từ 12 đến 32 giờ sau nuơi cấy.
7,5 8 8,5 9 9,5 10 10,5 11 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 h lo g (N/ m l)
Đồ thị 3: Đƣờng cong tăng trƣởng của chủng 1019
Đặc điểm sinh hĩa
Chủng cĩ hoạt tính catalase dƣơng tính và hoạt tính oxidase yếu.
Hợp chất Chủng 1019 Methylamine - Trimethylamine + Acetate + Citrate + L-Glutamate + D-Glucose + D-Xylose, L-arabinose + Fructose + Betaine + Tartrate + Serbacate +
Ethanol +
Nutrient agar +
Lactose +
Sucrose +
Chủng 1019 cĩ khả năng tổng hợp cytokinin và một lƣợng thấp auxin trên mơi trƣờng nuơi cấy mơ thƣc vật.
3.2.2 Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu
Thiết bị : tủ cấy vơ trùng, nồi hấp (autoclave), máy đo pH, cân phân tích, phịng nuơi cây…
Dụng cụ : pince, kéo, dao cấy, chai nƣớc biển, bình tam giác, đĩa petri, đèn cồn…
3.2.3 Mẫu cấy và điều kiện nuơi cấy
Mẫu cấy : các hạt lúa giống VĐ20
Điều kiện nuơi cấy : mơi trƣờng trƣớc khi cấy đƣợc hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1atm trong thời gian 20 phút.
Phịng nuơi cấy:
- Cƣờng độ ánh sáng 2000 lux - Nhiệt độ : 27 ± 2o
C - Ẩm độ 70%- 80%
- Thời gian chiếu sáng : 16h/ngày
3.2.4 Nhân sinh khối và giữ giống vi khuẩn
Chủng 1019 đƣợc giữ trong glycerol 10%, sau đĩ phân lập trên mơi trƣờng MMS + 1% methanol.
3.2.5 Mơi trƣờng nuơi cấy
Mơi trƣờng nuơi cấy là mơi trƣờng cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) (Phụ lục 1).
Mơi trƣờng phân lập và làm thuần chủng 1019 là mơi trƣờng MMS (methanol mineral salts) (Phụ lục 2): Mơi trƣờng MMS đƣợc thanh trùng bằng cách hấp ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút, sau đĩ để nguội và bổ sung methanol vào mơi trƣờng với thể tích từ 0,1 đến 0,2%, mơi trƣờng rắn cĩ bổ sung agar 20g/l trƣớc khi hấp. Hầu hết các chủng PPFM đều khơng cần vitamine hay các nhân tố tăng trƣởng khác trong quá trình tăng sinh.
Mơi trƣờng giữ giống chủng 1019 là mơi trƣờng Glycerol-Pepton Agar (Phụ lục 3).
* Các mơi trường đều được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút.
Các thành phần khác: - Đƣờng: 20g/l - Agar: 7g/l
pH mơi trƣờng trƣớc khi hấp: 5,7 – 5,8 Các chất kích thích sinh trƣởng:
- BAP (6- benzylamino purine) - NAA (α- naphthaleneacetic acid)
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1 Tạo vật liệu khởi đầu (mơ sẹo)
Các hạt lúa giống VĐ 20 sau khi khử trùng đƣợc cấy vào mơi trƣờng MS + 2 mg/l 2,4- D để tạo mơ sẹo [16].
Khử trùng mẫu:
Hạt lúa
bĩc vỏ trấu Rửa xà bơng trong 5-10 phút
Rửa sạch bằng nƣớc máy mang vơ tủ cấy Tráng bằng nƣớc cất vơ trùng
Lắc cồn 70o trong 1 phút
Lắc Javel (1 Javel:3 H2O) xấp mặt hạt đổ Javel
Rửa bằng nƣớc cất vơ trùng 3 lần
Gấp vào cấy
Các mẫu cấy đƣợc đặt trong tối, nhiệt độ 27 ± 2oC, ẩm độ 72%.
Theo dõi sự hình thành và phát triển của mơ sẹo sau 2, 3 tuần, sau đĩ sử dụng mơ sẹo làm vật liệu thí nghiệm.
Hình 3.2: Hạt lúa đã khử trùng trên mơi trƣờng tạo sẹo
3.3.2 Nhân sinh khối vi khuẩn
Nhân sinh khối vi khuẩn: vi khuẩn đƣợc cấy vào mơi trƣờng MMS (sử dụng phƣơng pháp đo OD để đạt mật độ 1010
tế bào/ml), lắc ở 37oC sau 87 giờ, sử dụng để bổ sung vào mơi trƣờng thí nghiệm.
3.3.3 Nội dung thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, tổng số mẫu ở mỗi nghiệm thức là 30 mẫu.
* Xử lý số liệu:
Phân tích thống kê: số liệu đƣợc xử lý thống kê theo phần mềm MSTATC, sau đĩ dựa vào giá trị Prob trong bảng ANOVA để quyết định nên trắc nghiệm phân hạng hay khơng. Nếu cĩ, dùng trắc nghiệm LSD hoặc trắc nghiệm Ducan, ở mức độ tin cậy 0,01 để đánh giá kết quả thí nghiệm.
3.3.3.1 Thí nghiệm 1: “ Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ 20” của giống lúa VĐ 20”
Mục tiêu thí nghiệm: xác định lại nồng độ 2,4-D tốt nhất cho khả năng nhân
sẹo ở giống lúa VĐ20.
Theo Đồn Thị Phƣơng Thùy [6] cĩ sự khác nhau giữa nồng độ auxin thích hợp cho sự hình thành mơ sẹo và nồng độ auxin thích hợp cho sự tăng trƣởng mơ sẹo của các giống lúa khác nhau, ở thí nghiệm này thay đổi nồng độ 2,4-D để xác định lại nồng độ auxin thích hợp cho khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20.
Mơi trƣờng nền (MTN): khống MS + 7g agar + 20g đƣờng + 1mg/l NAA +
0,5 mg/l BAP, bổ sung nồng độ 2,4-D [6]. Mẫu cấy: mơ sẹo cĩ diện tích bằng nhau. NT1: MTN + 0 mg/l 2,4-D
NT3: MTN + 2 mg/l 2,4-D NT4: MTN + 3 mg/l 2,4-D
Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi sự phát triển mơ sẹo sau khi cho nhiễm khuẩn ở các nồng độ khác nhau, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu:
theo dõi sự thay đổi trạng thái và kết cấu mơ sẹo: kích thƣớc, hình dạng, màu sắc.
3.3.3.2 Thí nghiệm 2: “ Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA lên khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20” tái sinh chồi từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20”
Mục tiêu thí nghiệm: xác định nồng độ BAP/NAA tốt nhất lên khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo.
Mơi trƣờng nền: khống MS + 7g agar + 20g đƣờng + bổ sung nồng độ BAP/NAA.
Mẫu cấy: mơ sẹo
NT1: MTN + 1 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA NT2: MTN + 1 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA NT3: MTN + 1 mg/l BAP + 1mg/l NAA NT4: MTN + 2 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA NT5: MTN + 2 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA NT6: MTN + 2 mg/l BAP + 1mg/l NAA
Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi khả năng tạo chồi từ mơ sẹo, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu:
tỷ lệ mẫu tái sinh (%) = (số mẫu tái sinh / số mẫu cấy)*100 số chồi trên mẫu = tổng số chồi / mẫu
3.3.3.3 Thí nghiệm 3: “ Ảnh hƣởng của nồng độ NAA lên khả năng tái sinh rễ từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20” từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20”