Các ứng dụng của vi khuẩn Methylobacterium sp

2.5.4.1 Tƣơng tác với thực vật

Giữa cây và vi khuẩn cĩ quan hệ tƣơng hỗ, một số vi khuẩn cĩ lợi cho cây

trồng vì chúng tham gia vào các chu trình sinh địa hố, cung cấp cho cây các chất

dinh dƣỡng cần thiết. Vi khuẩn dinh dƣỡng methyl chiếm tỷ lệ lớn trong hệ vi sinh

vùng lá của nhiều lồi cây. Kalyaeva và cộng sự (2000, 2003) phát hiện việc gây

nhiễm vi khuẩn Methylovorus mays và Methylomonas methanica vào mơi trƣờng

nuơi cấy invitro tạo mối liên kết bền vững giữa vi khuẩn và mơ thực vật [39], [40].

Thuốc lá, cây lanh và khoai tây khi nhiễm vi khuẩn tăng trƣởng mạnh hơn so với

đối chứng (số chồi tăng, rễ phát triển mạnh), ngay cả trên mơi trƣờng khơng cĩ

vitamine [35].

Hình 2.5: Sự tái sinh chồi của lồi cây thuốc lá chuyển gen ipt trên mơi trƣờng

MS khơng bổ sung hormone sau một tháng nuơi cấy. (a): khơng bổ sung vi

khuẩn Methylovorus mays. (b): cĩ bổ sung vi khuẩn Methylovorus mays [39]

Theo Maliti (2000), so với các vi khuẩn liên kết với thực vật khác thì vi

khuẩn Methylobacterium sp. là lồi tồn tại lâu dài và chiếm tỉ lệ lớn nhất khi bề

mặt lá đƣợc rửa sạch [46]. Holland và cộng sự (1994) đã đề cập đến việc khử

trùng thơng thƣờng trong khâu chuẩn bị nuơi cấy mơ khơng loại trừ đƣợc

Methylobacterium sp., dù đã xử lý với hypochlorite và cồn nhƣng các mơ sẹo phát

sinh từ mẫu cấy này vẫn cĩ nguy cơ bị nhiễm PPFM [35]. Đây là nhĩm vi khuẩn

rất phong phú và khơng gây bệnh thực vật. PPFM chiếm tỷ lệ lớn và cĩ mật độ từ

10

đến 10

đơn vị khuẩn lạc (cfu) trên mỗi gram trọng lƣợng tƣơi của mơ thực vật

[35]. Chúng lây nhiễm qua hạt [26], ở hạt đậu nành khơ mật độ là 10

cfu/gram

[35].

Tuy PPFM khơng tăng trƣởng nhanh nhƣ các vi khuẩn vùng lá khác trên

mơi trƣờng giàu dinh dƣỡng nhƣng chúng vẫn cĩ khả năng cạnh tranh tạo khuẩn

lạc trên lá. Một số tác giả cho rằng dinh dƣỡng methyl tuỳ ý ở PPFM là một phần

lý do duy trì mối quan hệ giữa chúng với thực vật. Bằng cách sử dụng nguồn thức

ăn khác thƣờng là methanol, PPFM cĩ thể loại bỏ chất độc này khỏi mơ thực vật

và cĩ đƣợc chỗ cƣ ngụ trong lá (mơi trƣờng chỉ thích hợp với một vài lồi vi

khuẩn) [44], [50].

Bên cạnh tính phổ biến và tồn tại lâu dài, cịn nhiều bằng chứng cho thấy

mặc dù PPFM thu nhận chất dinh dƣỡng từ cây chủ nhƣng khơng phải là mối quan

hệ một chiều. Các vi khuẩn này sử dụng nguồn carbon và khống chất từ cây,

đồng thời tham gia vào các quá trình sinh hố và chuyển hố quan trọng ở cây chủ.

Methylobacterium sp. nổi bật vì nhiều đặc tính quan trọng nhƣ khả năng tổng hợp

amino acid, PHB (Poly- -Hydrobutyrate); tổng hợp carotenoid, tăng cƣờng tạo

hƣơng vị ở dâu tây; tăng khả năng nảy mầm của hạt; khả năng phân hủy các hợp

chất 2,4,6-trinitrotoluene, nitramine…; khả năng phân hủy và chuyển hĩa một số

cơ chất khơng cần thiết ở thực vật thành sản phẩm cĩ giá trị [35].

Chủng PPFM đầu tiên đƣợc Basile và cộng sự (1969) phát hiện kích thích

sinh trƣởng ở cây địa tiền (Scapania nemorosa) trong điều kiện in vitro [9].

Kalyaeva và cộng sự (2000, 2003) phát hiện việc nhiễm vi khuẩn

Methylovorus mays và Methylomonas methanica vào mơi trƣờng nuơi cấy in vitro

tạo mối liên kết bền vững giữa vi khuẩn và mơ thực vật. Thuốc lá, cây lanh và

khoai tây khi nhiễm khuẩn tăng trƣởng mạnh hơn (số chồi tăng, rễ phát triển

mạnh) [39], [40].

Năm 1994, Holland và cộng sự cơng bố về khả năng tƣơng tác của vi khuẩn

Methylobacterium sp. và cây đậu nành trong việc chuyển hố nickel [35].

Cây lúa (Oryza sativa) cũng là một loại cây cĩ mối quan hệ mật thiết với

các vi khuẩn PPFM. Nhiều nhà nghiên cứu cũng đã chứng tỏ vi khuẩn

Methylobacterium sp. cĩ tác động tích cực lên sự sinh trƣởng và phát triển của cây

lúa cả trong điều kiện in vitro lẫn in vivo.

Maliti (2000) nghiên cứu, đánh giá ảnh hƣởng của một số chủng

Methylobacterium sp. đối với sự tăng trƣởng và phát triển của cây lúa ở 3 mức độ:

nuơi cấy mơ, cây con trong điều kiện in vitro và cây trƣởng thành trong mơi

trƣờng nhà kính. Kết quả cho thấy: vi khuẩn Methylobacterium sp. cĩ khả năng

làm gia tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt, tăng trọng lƣợng tƣơi, chiều cao cây mạ trong

điều kiện in vitro [46].

Năm 2004, Madhaiyan và cộng sự cũng đã tiến hành các thí nghiệm gây

nhiễm PPFM lên hạt lúa hay phun lên lá và kết quả cho thấy: vi khuẩn

Methylobacterium sp. cĩ hoạt tính kích thích tăng trƣởng, gia tăng khả năng đẻ

nhánh của lúa gĩp phần gia tăng năng suất lúa từ 22,1 đến 24,1%. Ngồi ra, các vi

khuẩn Methylobacterium sp. cịn cĩ vai trị ức chế các chủng vi khuẩn gây bệnh

trên cây lúa, gĩp phần làm giảm tỷ lệ cây bệnh từ 17,8-23,7%. Cơng trình của

Madhaiyan và cộng sự (2004) cũng đã chứng tỏ mối tƣơng quan giữa khả năng

kháng bệnh của cây lúa khi xử lý với vi khuẩn Methylobactreium sp. và sự gia

tăng polyphenol oxidase trong cây [47].

Qua các kết quả khảo sát về ảnh hƣởng của vi khuẩn Methylobactreium sp.

lên sự hình thành mơ sẹo ở cây thuốc lá và cây cúc cho thấy: vi khuẩn cĩ ảnh

hƣởng khác nhau lên quá trình hình thành mơ sẹo ở các loại mơ hay các loại cây

nuơi cấy. Đối với Chrysanthenum sp. vi khuẩn hạn chế sự hình thành mơ sẹo

nhƣng kích thích sự hình thành phơi ở các mơ sẹo này, trong khi đĩ ở Nicotiana

tabacum vi khuẩn lại ức chế quá trình hình thành mơ sẹo ở mơ phiến lá và mơ

lĩng thân. Nhƣ vậy, vi khuẩn Methylobacterium sp. cĩ khả năng tác động lên quá

trình biệt hĩa cơ quan ở thực vật. Ngồi vai trị tác động của vi khuẩn thì bản chất

của mơ và lồi thực vật cũng quyết định đến khả năng và chiều hƣớng phát sinh cơ

quan của nuơi cấy invitro. Bên cạnh đĩ các kết quả thí nghiệm cịn cho thấy rằng

vi khuẩn Methylobacterium sp. cịn cĩ khả năng tăng cƣờng quá trình hình thành

rễ ở P. fortunei và Chrysanthemum sp., so với đối chứng ở nghiệm thức cĩ bổ

sung vi khuẩn mẫu cấy thành lập rễ sớm hơn, nhiều hơn [9].

Ngồi PPFM, cịn cĩ những nghiên cứu sử dụng các lồi vi khuẩn cĩ lợi

khác nhƣ khảo sát sự tăng trƣởng và phát triển của cây hoa Cúc, cây hoa Bi Bi và

cây Địa Lan cĩ sự hiện diện của Bacillus spp. trong nuơi cấy in vitro [5] cho kết

quả: tuỳ theo từng loại cây mà Bacillus spp. cĩ tác dụng khác nhau nhƣ tăng chiều

cao, số lƣợng rễ, trọng lƣợng tƣơi. Vi khuẩn Methanotropic cĩ ảnh hƣởng đến sự

hình thành callus của hạt lúa mì, gia tăng sự tạo rễ, đồng thời gia tăng sự tái sinh

cây [40]. Với sự hiện diện của vi khuẩn Methylovorus mays trên mơi trƣờng nuơi

cấy làm tăng khả năng tái sinh chồi của cây thuốc lá chuyển gen ipt [39]. Từ

những kết quả này chứng tỏ giữa thực vật và vi sinh vật cĩ mối quan hệ tƣơng hỗ

cĩ lợi tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển và tăng trƣởng của thực vật trong

điều kiện in vitro và in vivo.

2.5.4.2 Sinh tổng hợp auxin và cytokinin

Khơng chỉ cĩ thực vật mà vi sinh vật cũng cĩ thể tổng hợp auxin và

cytokinin, đối với các vi khuẩn cĩ lợi và vi khuẩn tƣơng tác với thực vật thì đây cĩ

thể là nguyên nhân kích thích cây phát triển.

Omer và cộng sự (2004) đã khảo sát sự hiện diện của IAA trong mơi trƣờng

chứa dịch nổi của PPFM bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp kết hợp với phân

tích phổ NMR (Nuclear Mangnetic Radiation: cộng hƣởng từ hạt nhân) đã chứng

tỏ vi khuẩn PPFM cĩ khả năng tổng hợp hormone thực vật là IAA [50].

Holland và cộng sự (1994) kiểm tra mối quan hệ giữa PPFM, cytokinin và sự

phát triển của thực vật đã cho thấy PPFM cĩ ảnh hƣởng đến lƣợng cytokinin cĩ

trong mơ tế bào thực vật [35].

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian : từ tháng 3/2006 đến tháng 7/2006

Địa điểm : phịng thí nghiệm sinh học phân tử - khoa Sinh học - trƣờng Đại

học Khoa học Tự nhiên.

3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu

3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu

Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên giống lúa VĐ20 đƣợc cung cấp từ Cơng ty

cổ phần giống cây trồng Miền Nam.

* Đặc tính nơng học

Giống lúa VĐ 20: là giống lúa cao sản ngắn ngày, thời gian sinh trƣởng 95-

100 ngày, cây cao 85- 90 cm, năng suất 6- 8 tấn/ ha. Dạng hình khá, bơng to, ít

lép, chín sớm, nhiễm bệnh vàng lá, chịu phèn trung bình. Hạt gạo thon dài, khơng

bạc bụng, cơm thơm dẻo (Cơng ty cổ phần giống cây trồng Miền Nam).

(a) (b)

Hình 3.1: Giống lúa VĐ20: (a) hạt chƣa bĩc vỏ trấu, (b) hạt bĩc vỏ trấu

Chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. 1019 do phịng thí nghiệm sinh học

phân tử - khoa Sinh học - trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên phân lập cung cấp.

* Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hĩa của chủng 1019 [9]

Đặc điểm hình thái, sinh lý

Chủng 1019 là những vi khuẩn cĩ màu hồng, hình que ngắn, cĩ khả năng di

động, Gram âm, nhiệt độ tăng trƣởng thích hợp từ 25-35

C

Đặc điểm Chủng 1019

Màu sắc khuẩn lạc trên MMS Hồng nhạt

Đƣờng kính khuẩn lạc 2-3 mm

Hình dạng khuẩn lạc Trịn, lồi, nhầy, cĩ viền trắng

bên ngồi

Kích thƣớc tế bào 2-4 x 4-6 m

Khả năng di động Cĩ

Gram -

pH thích hợp 5,8 ± 1

Nhiệt độ 25-35

C

Hình dạng tế bào Dấu phẩy, phình to ở hai đầu

Trong giới hạn nồng độ các chất điều hịa tăng trƣởng thực vật thƣờng sử

dụng trong mơi trƣờng nuơi cấy mơ tế bào thực vật, thì nồng độ các chất điều hồ

tăng trƣởng thực vật khơng ảnh hƣởng tới sự phát triển của chủng 1019, do vậy

việc bổ sung hormone vào mơi trƣờng nuơi cấy thực vật sẽ khơng ảnh hƣởng đến

sự tăng trƣởng của vi khuẩn.

Chủng 1019 tăng trƣởng tối đa sau 30 giờ nuơi cấy do đĩ thời gian thích

hợp để thu nhận sinh khối tế bào là từ 12 đến 32 giờ sau nuơi cấy.

7,5 8 8,5 9 9,5 10 10,5 11 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44

h

lo

g (N/

m

l)

Đồ thị 3: Đƣờng cong tăng trƣởng của chủng 1019

Đặc điểm sinh hĩa

Chủng cĩ hoạt tính catalase dƣơng tính và hoạt tính oxidase yếu.

Hợp chất Chủng 1019

Methylamine -

Trimethylamine +

Acetate +

Citrate +

L-Glutamate +

D-Glucose +

D-Xylose,

L-arabinose ⁺

Fructose +

Betaine +

Tartrate +

Serbacate +

Ethanol +

Nutrient agar +

Lactose +

Sucrose +

Chủng 1019 cĩ khả năng tổng hợp cytokinin và một lƣợng thấp auxin trên

mơi trƣờng nuơi cấy mơ thƣc vật.

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu

Thiết bị : tủ cấy vơ trùng, nồi hấp (autoclave), máy đo pH, cân phân tích,

phịng nuơi cây…

Dụng cụ : pince, kéo, dao cấy, chai nƣớc biển, bình tam giác, đĩa petri, đèn

cồn…

3.2.3 Mẫu cấy và điều kiện nuơi cấy

Mẫu cấy : các hạt lúa giống VĐ20

Điều kiện nuơi cấy : mơi trƣờng trƣớc khi cấy đƣợc hấp khử trùng ở 121

C,

áp suất 1atm trong thời gian 20 phút.

Phịng nuơi cấy:

- Cƣờng độ ánh sáng 2000 lux

- Nhiệt độ : 27 ± 2

C

- Ẩm độ 70%- 80%

- Thời gian chiếu sáng : 16h/ngày

3.2.4 Nhân sinh khối và giữ giống vi khuẩn

Chủng 1019 đƣợc giữ trong glycerol 10%, sau đĩ phân lập trên mơi trƣờng

MMS + 1% methanol.

3.2.5 Mơi trƣờng nuơi cấy

Mơi trƣờng nuơi cấy là mơi trƣờng cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962)

(Phụ lục 1).

Mơi trƣờng phân lập và làm thuần chủng 1019 là mơi trƣờng MMS

(methanol mineral salts) (Phụ lục 2): Mơi trƣờng MMS đƣợc thanh trùng bằng

cách hấp ở nhiệt độ 121

C trong 20 phút, sau đĩ để nguội và bổ sung methanol

vào mơi trƣờng với thể tích từ 0,1 đến 0,2%, mơi trƣờng rắn cĩ bổ sung agar 20g/l

trƣớc khi hấp. Hầu hết các chủng PPFM đều khơng cần vitamine hay các nhân tố

tăng trƣởng khác trong quá trình tăng sinh.

Mơi trƣờng giữ giống chủng 1019 là mơi trƣờng Glycerol-Pepton Agar (Phụ

lục 3).

* Các mơi trường đều được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121

C trong 20 phút.

Các thành phần khác:

- Đƣờng: 20g/l

- Agar: 7g/l

pH mơi trƣờng trƣớc khi hấp: 5,7 – 5,8

Các chất kích thích sinh trƣởng:

- BAP (6- benzylamino purine)

- NAA (α- naphthaleneacetic acid)

3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu

3.3.1 Tạo vật liệu khởi đầu (mơ sẹo)

Các hạt lúa giống VĐ 20 sau khi khử trùng đƣợc cấy vào mơi trƣờng MS + 2

mg/l 2,4- D để tạo mơ sẹo [16].

Khử trùng mẫu:

Hạt lúa

bĩc vỏ trấu

Rửa xà bơng trong 5-10 phút

Rửa sạch bằng nƣớc máy

mang vơ tủ cấy

Tráng bằng nƣớc cất vơ trùng

Lắc cồn 70

trong 1 phút

Lắc Javel (1 Javel:3 H2O) xấp mặt hạt

đổ Javel

Rửa bằng nƣớc cất vơ trùng 3 lần

Gấp vào cấy

Các mẫu cấy đƣợc đặt trong tối, nhiệt độ 27 ± 2

C, ẩm độ 72%.

Theo dõi sự hình thành và phát triển của mơ sẹo sau 2, 3 tuần, sau đĩ sử

dụng mơ sẹo làm vật liệu thí nghiệm.

Hình 3.2: Hạt lúa đã khử trùng trên mơi trƣờng tạo sẹo

3.3.2 Nhân sinh khối vi khuẩn

Nhân sinh khối vi khuẩn: vi khuẩn đƣợc cấy vào mơi trƣờng MMS (sử dụng

phƣơng pháp đo OD để đạt mật độ 10

tế bào/ml), lắc ở 37

C sau 87 giờ, sử dụng

để bổ sung vào mơi trƣờng thí nghiệm.

3.3.3 Nội dung thí nghiệm

Thí nghiệm đƣợc bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, tổng số mẫu ở

mỗi nghiệm thức là 30 mẫu.

* Xử lý số liệu:

Phân tích thống kê: số liệu đƣợc xử lý thống kê theo phần mềm MSTATC,

sau đĩ dựa vào giá trị Prob trong bảng ANOVA để quyết định nên trắc nghiệm

phân hạng hay khơng. Nếu cĩ, dùng trắc nghiệm LSD hoặc trắc nghiệm Ducan, ở

mức độ tin cậy 0,01 để đánh giá kết quả thí nghiệm.

3.3.3.1 Thí nghiệm 1: “ Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ 20”

của giống lúa VĐ 20”

Mục tiêu thí nghiệm: xác định lại nồng độ 2,4-D tốt nhất cho khả năng nhân

sẹo ở giống lúa VĐ20.

Theo Đồn Thị Phƣơng Thùy [6] cĩ sự khác nhau giữa nồng độ auxin thích

hợp cho sự hình thành mơ sẹo và nồng độ auxin thích hợp cho sự tăng trƣởng mơ

sẹo của các giống lúa khác nhau, ở thí nghiệm này thay đổi nồng độ 2,4-D để xác

định lại nồng độ auxin thích hợp cho khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20.

Mơi trƣờng nền (MTN): khống MS + 7g agar + 20g đƣờng + 1mg/l NAA +

0,5 mg/l BAP, bổ sung nồng độ 2,4-D [6].

Mẫu cấy: mơ sẹo cĩ diện tích bằng nhau.

NT1: MTN + 0 mg/l 2,4-D

NT3: MTN + 2 mg/l 2,4-D

NT4: MTN + 3 mg/l 2,4-D

Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi sự phát triển mơ sẹo sau khi cho nhiễm khuẩn ở

các nồng độ khác nhau, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu:

theo dõi sự thay đổi trạng thái và kết cấu mơ sẹo: kích thƣớc, hình dạng,

màu sắc.

3.3.3.2 Thí nghiệm 2: “ Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA lên khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20”

tái sinh chồi từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20”

Mục tiêu thí nghiệm: xác định nồng độ BAP/NAA tốt nhất lên khả năng tái

sinh chồi từ mơ sẹo.

Mơi trƣờng nền: khống MS + 7g agar + 20g đƣờng + bổ sung nồng độ

BAP/NAA.

Mẫu cấy: mơ sẹo

NT1: MTN + 1 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA

NT2: MTN + 1 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA

NT3: MTN + 1 mg/l BAP + 1mg/l NAA

NT4: MTN + 2 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA

NT5: MTN + 2 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA

NT6: MTN + 2 mg/l BAP + 1mg/l NAA

Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi khả năng tạo chồi từ mơ sẹo, 7 ngày theo dõi 1

lần. Các chỉ tiêu:

tỷ lệ mẫu tái sinh (%) = (số mẫu tái sinh / số mẫu cấy)*100

số chồi trên mẫu = tổng số chồi / mẫu

3.3.3.3 Thí nghiệm 3: “ Ảnh hƣởng của nồng độ NAA lên khả năng tái sinh rễ từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20”

từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20”