II. Phương pháp nhân giống
2.4.5Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy
Hiện tượng mẫu hóa nâu hay bị đen là chết mẫu hay làm giảm sự tăng trưởng. Nguyên nhân của hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa nhiều tannin hay hydroxyphenol có nhiều trong mô già hơn mô sẹo
Một số phương pháp làm giảm sự hóa nâu mẫu: + Tách các phần tử phenol ra khỏi môi trường.
+ Bổ sung các chất khử redox (oxidation-redution) vào môi trường. + Ngăn chặn sự hoạt động của enzyme phenolase.
+ Giảm lượng phenol có sẵn trong mẫu bằng môi trường lỏng hoặc bán rắn.
+ Mẫu chuẩn bị có vết cắt nhỏ, để ngoài vài giờ trước khi cấy, hay nơi cấy trong môi trường không có ánh sáng.
Than hoạt tính được đưa vào môi trường để hấp thụ chất kìm hãm phenol, ngăn chặn quá trình hóa nâu hay đen, đặc biệt có hiệu quả trên các loại phong lan, nồng độ thường 0,1-0,3%. Tuy nhiên than hoạt tính sẽ làm chậm quá trình phát triển của mô do hấp thụ chất kích thích sinh trưởng và các chất khác. Polyvinylpyrolidone (pvp), một chất thuộc loại polyamide, hấp thụ phenol qua vòng hydrogen, ngăn chặn sự hóa nâu, các loài cây trồng khác nhau đạt hiệu quả khác nhau.
Các chất khử quá trình oxi hóa có thể ngăn chặn sự oxi hóa phenol. Chất khử thường dùng: vitamin C, axit citric, L-cystein hydroclorit, gluta thione, và mecaptoethanol. Phương pháp quan trọng là phối hợp vitaminC và axit citric.
Phương pháp đề nghị:
+ Sử dụng mẫu cấy nhỏ từ mô sẹo
+ Gây vết thương trên mẫu nhỏ nhất khi khử trùng
+ Ngâm mẫu vào dung dịch vitamin C và axit citric vài giờ trước khi cấy
+ Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, O2 thấp không có đèn 1-2 tuần chuyển mẫu từ môi trường có nồng độ chất kích thích sinh trưởng thấp sang môi trường có nồng độ cao.