Tiến hành phân tích thành phần chính của nguyên liệu ba vùng là Thái Bình, Quảng Bình và Quảng Trị đối với 3 loại nguyên liệu: rễ trồng 1 năm, rễ trồng 2 năm, rễ trồng 3 năm.
2.2.1.1. Phương pháp xác định độ ẩm của nguyên liệu
Độ ẩm nguyên liệu được xác định bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi.
Cách tiến hành: Cân chính xác 10g nguyên liệu đã được cắt nhỏ, sau đó sấy ở 1050C đến khối lượng không đổi. Độ ẩm được xác định theo công thức:
m1 – m2
W = x 100 (%) m
Trong đó:
W: Độ ẩm của nguyên liệu, %
m1: Khối lượng nguyên liệu ban đầu, g
m2: Khối lượng nguyên liệu sau khi sấy, g
Hàm lượng tinh dầu hương bài được xác định bằng phương pháp trích ly. Cách tiến hành như sau:
Cân chính xác 100g nguyên liệu đã được xay cho vào bình cầu 2000ml, sau đó tiến hành trích ly động 4 lần bằng dung môi metanol, tốc độ khuấy 400 v/ph ở nhiệt độ 600C, thời gian 14h, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1: 25. Dịch trích ly của cả 4 lần được cô đuổi kiệt dung môi thu nhận tinh dầu hương bài thô.
Sau đó tinh dầu thô được tiến hành tinh chế theo phương pháp sau:
Cho tinh dầu hương bài thô cùng với nước cất, hỗn hợp dung môi ete petrol và n-hexan vào phễu chiết, tiến hành quá trình trích ly. Quá trình trích ly được lặp lại 4 lần. Lớp trên có chứa tinh dầu được hợp lại và làm khô bằng sunphat natri khan. Tiếp đó lọc bỏ phần chất rắn, dung dịch trong suốt được đuổi kiệt dung môi trên thiết bị cô quay đến khối lượng không đổi, ta thu được tinh dầu sạch.
Hiệu suất thu nhận tinh dầu được xác định theo công thức sau: m1 . 104
X = (%) m . (100 - W) Trong đó:
X : Hàm lượng tinh dầu so với tổng chất khô có trong nguyên liệu, % m : Khối lượng nguyên liệu, g
m1 : Khối lượng tinh dầu sạch thu được sau khi trích ly, g W : Độ ẩm của nguyên liệu, %
Hàm lượng tinh bột được xác định dựa trên nguyên tắc: Dưới tác dụng của axít, tinh bột bị thuỷ phân tạo thành đường glucoza. Xác định hàm lượng đường glucoza tạo thành rồi nhân với hệ số 0,9 ta được hàm lượng tinh bột. (C6H12O5)n + n H2O n C6H12O6
162,1 18,02 180,12 162,1
F = = 0,90 180,12 180,12
Thuỷ phân tinh bột trong nguyên liệu bằng axít HCl. Sau đó xác định hàm lượng đường khử mới tạo thành bằng phương pháp Ixekuzt. Cách tiến hành cụ thể như sau:
- Cân khoảng 2g nguyên liệu đã được nghiền nhỏ và biết trước độ ẩm. Chuyển nguyên liệu vào cốc với 100ml nước cất, dùng đũa thuỷ tinh khuấy đều để loại bỏ đường tan trong khoảng 45 - 60 phút. Sau đó lọc tinh bột bằng phễu có giấy lọc và rửa tinh bột nhiều lần bằng nước cất. Chuyển phễu lọc sang bình cầu 250ml, dùng đũa thuỷ tinh chọc thủng giấy lọc, chuyển tinh bột xuống bằng nước cất (chính xác 100ml). Hút 10ml dịch thuỷ phân và 2 ml HCl 6N vào bình cầu, lắp hệ thống ống sinh hàn. Đặt bình cầu vào nồi cách thuỷ đun ở nhiệt độ 70- 800C trong khoảng 2,5-3h, thỉnh thoảng lắc đều. Sau khi kết thúc thuỷ phân tinh bột, làm nguội bình, trung hoà dung dịch thuỷ phân bằng NaOH 10%, với chất chỉ thị là phenolphtalein đến khi có mầu hồng thì dừng lại. Sau đó thêm CH3COOH 10% đến khi mất mầu hồng để dung dịch thuỷ phân đã được trung hoà có độ axít yếu. Chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch định mức của bình. Khuấy đều, lọc dung dịch - dung dịch lọc trong suốt để định lượng đường khử (glucoza).
- Định lượng đường khử bằng phương pháp Ixekuzt: Lấy 2 bình tam giác: bình 1 (mẫu đối chứng), bình 2 (mẫu thí nghiệm):
+ Cho vào bình 1 chính xác 10ml nước cất, bình 2 chính xác 10ml dịch chiết đường. Cho vào mỗi bình 10ml nước cất, 10ml K3Fe(CN)6 0.05N. Đun sôi 1 phút trên bếp điện, để nguội. Cho vào mỗi bình 10ml hỗn hợp KI + ZnSO4, 10ml CH3COOH 10%.
+ Chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,05N cho đến khi có màu vàng rơm. Thêm 3 giọt dung dịch tinh bột (dung dịch chuyển màu xanh), chuẩn độ tiếp cho đến khi có màu trắng sữa hoàn toàn. Ghi thể tích Na2S2O3 0,05N đã dùng. Kết quả được tính theo công thức:
a . V . 104 X = x 0,9 (%) m1 . (100 - W) . V1 Trong đó: X: Hàm lượng tinh bột, %
a: Số mg đường khử (tra bảng trong tài liệu)
V: Thể tích dịch chiết đường đã định mức (100ml) V1: Thể tích dịch chiết đường lấy để phân tích (10ml) m: Khối lượng mẫu, g
W: Độ ẩm của mẫu, %
0,9: Hệ số chuyển tinh bột thành đường
Phương pháp định lượng xenluloza dựa vào tính chất của nó trong một hợp chất bền với tác dụng của axít và kiềm mạnh, không bị phân huỷ dưới tác dụng của axít yếu.
Đem một lượng mẫu rễ cỏ hương bài đã nghiền nhỏ sấy ở 1050C đến khối lượng không đổi. Cân chính xác 1,0g mẫu vào bình tam giác, rồi cho vào đó 50ml H2SO4 8%, 50ml nước cất, đun sôi 10 phút trên bếp điện, sau đó lọc bằng giấy lọc.
Lấy bình tam giác đun sôi nước cất để tráng phần bã lọc (cho các chất khác như đường, tinh bột đi qua hết). Sau đó dồn hết phần bã còn lại trên giấy lọc vào bình tam giác, tráng giấy lọc bằng nước cất đã đun sôi, rồi cho vào bình 9 - 10ml NaOH 30%, đun sôi 10 phút trên bếp điện, sau đó để nguội và tiếp tục lọc trên tờ giấy lọc đã sấy khô và biết trước khối lượng.
Rửa phần bã trên giấy lọc bằng nước cất nóng nhiều lần rồi đem tờ giấy lọc (có chứa bã) sấy ở 1050C đến khối lượng không đổi. Lượng bã còn lại trên giấy lọc sau khi sấy khô chính là xenluloza.
Hàm lượng xenluloza được tính theo công thức: a . 100
X = (%) b
Trong đó:
X: Hàm lượng xenluloza, %
a: Khối lượng xenluloza thu được, g
b: Khối lượng nguyên liệu khô đem phân tích, g
Cách tiến hành:
- Cân chính xác 3g mẫu sau đó dùng nước cất lên thể tích 100ml, tiến hành lọc để thu lấy dung dịch phân tích.
- Lấy 10ml dung dịch vừa lọc cho vào ống nghiệm cao, cho thêm 2ml HCl 6N, tiến hành thuỷ phân ổn nhiệt ở nhiệt độ 70- 800C trong 20-30 phút để tất cả chuyển thành đường khử. Để nguội, cho 3 giọt phenolphtalein rồi chuẩn độ bằng NaOH 10% đến khi xuất hiện mầu hồng, làm chua lại bằng axít CH3COOH 10% cho hết mầu hồng. Cho toàn bộ dung dịch trên vào bình định mức 50ml, dùng nước cất lên thể tích đến vạch định mức của bình thu được dung dịch đường khử.
- Định lượng đường khử bằng phương pháp Ixekuzt: Lấy 2 bình tam giác: Bình 1 (mẫu đối chứng), bình 2 (mẫu thí nghiệm).
+ Cho vào bình 1 chính xác 10ml nước cất, bình 2 chính xác 10ml dịch chiết đường. Cho vào mỗi bình 10ml nước cất, 10ml K3Fe(CN)6 0.05N. Đun sôi 1 phút trên bếp điện, để nguội. Cho vào mỗi bình 10ml hỗn hợp KI+ ZnSO4, 10ml CH3COOH 10%.
+ Chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,05N cho đến khi có màu vàng rơm. Thêm 3 giọt tinh bột (dung dịch chuyển màu xanh), chuẩn độ tiếp cho đến khi có màu trắng sữa hoàn toàn. Ghi thể tích Na2S2O3 0,05N đã dùng.
Kết quả được tính theo công thức: a . V . 100
X = x I (%) v . C . 100
Trong đó:
a: Lượng glucoza có trong dung dịch xác định, mg v: Thể tích dung dịch mẫu nghiên cứu, 10ml V: Toàn bộ thể tích dịch mẫu đã chiết, 100ml C: Lượng mẫu phân tích, g
I: Số lần pha loãng (5lần)
2.2.1.6. Xác định hàm lượng protein
a. Định lượng nitơ tổng số (theo phương pháp Kjeldhal) - Giai đoạn 1: Vô cơ hoá mẫu nghiên cứu.
+ Cân mẫu, chuyển mẫu vào bình Kjeldhal.
+ Công phá mẫu: Sau khi cho mẫu vào bình Kjeldhal, thêm vài giọt nước cất không chứa nitơ để thấm ướt mẫu và một lượng H2SO4 đậm đặc (0,1g mẫu khô cho 1ml H2SO4 đậm đặc). Đậy kín bình để yên trong 30 phút hoặc qua đêm. Thay nút bình bằng phễu thuỷ tinh để khí độc CO2, SO2 thoát ra ngoài từ từ, tránh gây ô nhiễm môi trường. Đặt bình Kjeldhal nghiêng 450C trên hệ thống đốt mẫu trong tủ hút. Đun nhẹ trong 30 phút, tăng dần nhiệt độ để dung môi sôi đều, không nên nâng quá cao (1000C) làm dung dịch bắn ra ngoài. Trong quá trình đun, dung dịch chuyển từ màu đen sang màu nâu sẫm. Lấy bình ra để nguội, thêm 3 - 4 giọt HClO4 để xúc tác cho phản ứng vô cơ hoá diễn ra nhanh hơn. Đun tiếp, màu dung dịch chuyển sang màu nâu cánh gián đến màu vàng nhạt, cuối cùng được dung dịch trắng trong.
+ Pha loãng dung dịch đã vô cơ hoá: Để nguội bình Kjeldhal, sau đó chuyển dung dịch sang bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch.
- Bình cất mẫu: Hút 20ml dịch mẫu cho vào bình cất 2-3 giọt chỉ thị taxiro, khi dung dịch chuyển sang màu tím đỏ cho thêm vào dung dịch NaOH 33% đến khi dung dịch chuyển sang màu vàng xanh thì dừng lại.
- Bình hứng mẫu: Cho vào mỗi bình 25ml axít boric 2.5% và 2-3 giọt chỉ thị taxiro.
Tiến hành cất trên máy Microkjeldhal.
Hàm lượng nitơ tổng số có trong nguyên liệu được tính theo công thức: (a – b) . 0,142. V . 104
NTS = (%) v . m . (100 - W)