pháp nuôi cấy phân lập, định danh vi khuẩn
Phương pháp phân lập xác định vi khuẩn gây bệnh dựa trên phương pháp nghiên cứu của Bergey (1957) và Nguyễn Lân Dũng (2006).
3.5.3.1. Nuôi cấy phân lập
Lấy mẫu bệnh phẩm: Cơ, mang, chân bơi, gan tụy của mẫu tôm được phân nhỏ, nghiền trong ống nghiệm chứa 2ml dung dịch nước muối sinh lý. Dùng que cấy vô trùng, lấy bệnh phẩm vạch trên đĩa thạch TCBS một số đường để được vùng 1. Hơ nóng đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn. Để nguội bằng cách ấn dần que cấy vào mép đĩa thạch. Đặt que cấy lên đĩa thạch tại vùng 1, vạch một số đường liên tiếp để được vùng 2. Tiếp tục như vậy ta được vùng 3.
Lật ngược đĩa lồng, nuôi cấy ở nhiệt độ 30-370C, trong 24 giờ.
Sau 24 giờ, kiểm tra sự phát triển của các khuẩn lạc. Dựa vào màu sắc, hình dạng, kích thướt khuẩn lạc để phân biệt các loại khuẩn lạc có trên đĩa lồng, từ đó chọn ra khuẩn lạc nghi ngờ. Khuẩn lạc nghi ngờ là khuẩn lạc chiếm ưu thế trên đĩa phân lập.
3.5.3.2. Nuôi cấy thuần chủng
Mở đĩa các khuẩn lạc nghi ngờ (dưới ngọn đèn cồn).
Dùng que cấy vô trùng, lấy bệnh phẩm từ một khuẩn lạc nghi ngờ riêng rẽ. Cấy lên đĩa thạch mới, để ở nhiệt độ 30-370C, trong 24h sẽ có một đĩa lồng chứa vi khuẩn thuần chủng.
3.5.3.3. Phương pháp nhuộm vi khuẩn
Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc. Dùng que cấy phết, dàn một lớp mỏng trên tấm lam sạch. Để mẫu tự khô ở nhiệt độ phòng, sau đó hơ cao tấm lam trên ngọn lửa đèn cồn.
Nhuộm Gram theo các bước sau:
+ Nhỏ dung dịch tím Crystal lên mẫu để 30 - 60 giây. + Rửa nhanh bằng nước, rảy khô nước.
+ Nhỏ dung dịch Lugol lên mẫu để 1 phút. + Rửa nhanh rảy khô nước.
+ Nghiêng lam kính, nhỏ cồn 96% lên tẩy màu. + Rửa nhanh bằng nước, rảy khô nước.
+ Nhỏ dung dịch Fuchsin lên mẫu, để 1 - 2 phút.
Rửa nước, rảy khô nước, có thể dùng khăn giấy thấm làm khô tiêu bản nhưng không để xước mẫu. Nhỏ dầu lên tiêu bản, đem soi dưới kính hiển vi (vật kính dầu). Nếu mẫu giữ nguyên màu xanh tím là vi khuẩn Gram dương, nếu mẫu chuyển màu hồng là vi khuẩn Gram.
3.5.3.4. Phương pháp thử các phản ứng sinh hóa - Thử phản ứng trên môi trường KIA.
Dùng que cấy thẳng vô trùng lấy vi khuẩn nghiên cứu ria một đường thẳng ở phần thạch nghiêng.
Sau đó cắm thẳng que cấy xuống phần thạch đứng (không chạm đáy). Nuôi cấy ở nhiệt độ 30 - 370C, trong 24 giờ rồi đọc kết quả.
Đọc khả năng lên đường glucose: Nếu (+), phần thạch đứng chuyển sang màu vàng. Nếu âm tính (-), phần thạch đứng vẫn giữ màu vàng môi trường.
Đọc khả năng lên men đường lactose: Nếu dương tính (+), phần thạch nghiêng chuyển màu vàng. Nếu âm tính (-), phần thạch nghiêng không chuyển màu.
Nếu có khả năng lên men cả hai loại đường: Toàn bộ ống nghiệm chuyển sang màu vàng.
Nếu không có khả năng len men cả 2 loại đường thì toàn bộ ống nghiệm vẫn giữ nguyên màu của môi trường ban đầu
Đọc khả năng sinh hơi: (+) khi thạch bị nứt hay bị đẩy lên trên. Âm tính (-) khi không có hiện tượng nứt thạch.
Đọc khả năng sinh H2S: (+) khi môi trường có màu đen. (-) khi môi trường không có màu đen.
- Thử khả năng sinh Indol.
Dùng môi trường Trypton lỏng cho phản ứng này.
Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn cần nghiên cứu, cấy vào môi trường chứa Tryptone lỏng.
Nuôi ở nhiệt độ 30-370C, trong 24 giờ. Dùng thuốc thử Kovac nhỏ 0,2-0,3 ml vào ống nghiệm đã nuôi cấy vi khuẩn, lắc đều, sau đó đọc kết quả:
Dương tích (+): Có một vòng đỏ sẫm nổi lên trên bờ mặt môi trường.
Âm tính (-): Có một vòng màu vàng sẫm nổi lên trên môi trường. Đó là màu của thuốc thử Kovac.
- Thử khả năng di động.
Dùng môi trường Manitol di động.
Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn cần nghiên cứu, cấy một đường thẳng đứng chính giữ ống nghiệm.
Nuôi ở nhiệt độ 30-370C, trong 24h, đọc kết quả:
Khả năng lên men đường Manitol: (+) môi trường có màu vàng, (-) môi trường giữ nguyên màu ban đầu.
Khả năng di động: (+) vi khuẩn mọc thành một đường thẳng, (-) vi khuẩn mọc lan ra ngoài đường cấy.
- Thử phản ứng Nitrate.
Nuôi ở nhiệt độ 30-370C trong 24h.
Nhỏ thuốc thử: 1ml Acid Sulfalinic và 1ml Naphthyllamiue.
Đọc kết quả: (+) xuất hiện màu đỏ 1-2 phút. (-) không xuất hiện màu đỏ. - Thử phản ứng Citrate.
Dùng môi trường Simoms Citrate Agar đựng trong các ống nghiệm. Cấy vi khuẩn nghiên cứu vào ống nghiệm chứa môi trường Simoms Citrate Agar.
Nuôi ở nhiệt độ 30 - 370C trong 24 – 48 giờ.
Đọc kết quả: (+) Sẽ xuất hiện màu xanh blue. (-) Vẫn giữ nguyên màu xanh lá cây của môi trường.
- Thử phản ứng Methyl Red.
Dùng ống nghiệm chứa môi trường lỏng MR-VP để thử phản ứng này. Dùng que cấy vô trùng, lấy vi khuẩn cần nghiên cứu, cấy vào môi trường trên. Để ở nhiệt độ 30-370C trong 24 - 48 giờ.
Nhỏ 5 giọt thuốc thử Methyl Red, lắc đều và đọc kết quả: (+) Xuất hiện màu đỏ, (-) Xuất hiện màu vàng, vừa âm vừa dương tính – xuất hiện màu vàng cam.
- Thử phản ứng V-P (Voges – Proskaner test). Dùng một ống nghiệm chứa môi trường MR-VP lỏng. Cấy vi khuẩn lên môi trường cần nói trên.
Nuôi ở nhiệt độ 30-370C trong 24 – 48 giờ.
Nhỏ vào ống môi trường đã cấy vi khuẩn: 1ml Alpha – Naphthol 10% và 1ml KOH 20%. Lắc nhẹ sau ít phút rồi đọc kết quả.
(+): Xuất hiện màu đỏ da cam ở bờ mặt môi trường trong ống nghiệm (-): Xuất hiện màu xanh đồng.
- Kiểm tra khả năng lên men các loại đường của vi khuẩn.
Dùng các ống nghiệm có chứa môi trường đường khác nhau: Mantose, sucrose, glucose,...
Nuôi ở nhiệt độ 30-370C trong 24h.
Đọc kết quả: (+) Môi trường chuyển từ màu hồng sang màu vàng, (-) Môi trường không thay đổi màu sắc.
3.5.3.5. Phương pháp định danh vi khuẩn
Dựa vào kết quả nuôi cấy phân lập, nhuộm vi khuẩn kết hợp với kết quả thực hiện các phản ứng sinh hóa để định danh vi khuẩn theo khoá phân lập của Bergey (1957) và Nguyễn Lân Dũng (2006)