Số liệu thu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm Excell
Hình 4.1. Dấu hiệu bên ngoài của tôm bị bệnh
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. Trọng lượng, chiều dài tôm thẻ chân trắng bị bệnh
Kiểm tra trọng lượng, chiều dài mẫu bệnh phẩm đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán bệnh trên động vật thủy sản do mỗi loại tác nhân thường cảm nhiễm ở một giai đoạn nhất định của đối tượng nuôi. Tôm thẻ chân trắng dễ mẫn cảm với nhiều loại tác nhân gây bệnh khác nhau nên việc xác định giai đoạn phát triển của tôm sẽ giúp khoanh vùng được tác nhân gây bệnh để đưa ra kết quả chính xác hơn trong quá trình phân lập. Kết quả kiểm tra trọng lượng, chiều dài được thể hiện qua bảng 4.1.
Bảng 4.1: Trọng lượng, chiều dài mẫu tôm bị bệnh
Kết quả bảng 4.1 cho thấy tôm có Ptb 8,18 g/con, Ltb 11,04 cm/con . Trong giai đoạn này tôm gần thu hoạch nếu bị các tác nhân gây bệnh xâm nhập sẽ gây thiệt hại nặng nề. Theo Đỗ Thị Hòa, 2004 giai đoạn này tôm rất dễ bị cảm nhiều bởi nhiều loại tác nhân gây bệnh khác nhau do lượng thức ăn dư thừa trong ao nuôi tạo điều kiện cho các vi sinh vật gây bệnh phát triển đặc biệt đối với vi khuẩn gây bệnh.
4.2. Kết quả phân lập, định danh vi khuẩn gây bệnh.
4.2.1 Kết quả quan sát dấu hiệu bệnh lý
Mẫu bệnh phẩm có hiện tượng bẩn mình, bẩn mang, xuất hiện màu hồng đỏ trên cơ thể. Một số khác xuất hiện các vùng mềm trên vỏ kitin, tạo nên các điểm nâu, đen hay trắng hoặc vỏ kitin bị ăn mòn, các phần phụ như chân bò, chân bơi, râu, đuôi tôm phòng lên, mòn cụt, gan tụy hoại tử từng phần.
Trọng lượng (g/con) MD ± SD
Chiều dài (cm/con) MD ± SD
4.2.2. Kết quả phân lập, định danh vi khuẩn
Bảng 4.2. Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh trên tôm thẻ chân trắng
Đặc điểm sinh hoá Kết quả
Chủng 1 Chủng 2
Màu sắc khuẩn lạc Vàng Xanh
Hình dạng khuẩn lạc Tròn, bóng Tròn, bóng
Nhiệt độ phát triển 370C 370C
Nhuộm Gram - -
Hình dạng vi khuẩn Que, ngắn Que, ngắn
Đặc điểm khuyếch tán Làm biến đổi màu của môi trường nuôi cấy
Không làm biến đổi môi trường nuôi cấy Lên men: Glucose
Lactose Maltose Saccharose Manitol + - + + + + + + - + Khả năng di động + +
Khả năng sinh hơi + -
Khả năng sinh Indol + +
Phản ứng trên môi trường KIA -/+ -/+
Phản ứng Methyl red - + Phản ứng Citrate ... - α – Naptol - - Phản ứng V-P + - Khả năng phát sáng - + Khả năng sinh H2S - -
Qua các đợt thu mẫu tôm thẻ chân trắng bị bệnh, đã tiến hành phân lập, thử phản ứng sinh hoá đối với các chủng vi khuẩn phân lập được. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.2.
Dựa vào kết quả thu được trong quá trình nuôi cấy phân lập kết hợp khóa phân lập của Bergey (1957) và Nguyễn Lân Dũng (2006) đã xác định được 2 chủng vi khuẩn Vibrio harveyi, Vibrio alginolyticus từ các mẫu tôm thẻ có dấu hiệu bệnh lý. Hai chủng vi khuẩn này thuộc vi khuẩn Gram (-) (hình 4.2 và 4.3), tế bào có dạng hình que ngắn, có khả năng di động, phát triển trên môi rường thạch chọn lọc TCBS, cho khuẩn lạc có màu đặc trưng rõ rệt: Màu vàng của
V.alginolyticus (Hình 4.4), màu xanh của V.harveyi (Hình 4.5).
Hình 4.2. Vibrio alginolyticus Hình 4.3. Vibrio harveyi
Theo Bùi Quang Tề (năm 2002), các loài vi khuẩn Vibrio xuất hiện ở nhiều thủy vực mặn lợ đặc biệt trong các vùng nuôi tôm thâm canh, gây ra các bệnh chủ yếu trên tôm như: Bệnh đỏ dọc thân, bệnh ăn mòn vỏ giáp xác, bệnh mềm vỏ... Những vi khuẩn này thường đóng vai trò tác nhân cơ hội, khi tôm sốc do môi trường biến đổi, hoặc bị nhiễm các bệnh khác như virus, nấm, kí sinh trùng. Khi sức đề kháng của động vật thuỷ sản giảm, các loài vi khuẩn vibrio này có khả năng gây bệnh nặng, gây chết hàng loạt. Vi khuẩn Vibrio harveyi thường phân bố trong nước biển, ven bờ...gây bệnh cho giáp xác, đặc biệt ở tôm nước mặn, lợ.
Theo Đỗ Thị Hòa (2004), sự khác nhau về sự khuếch tán màu sắc trên môi trường TCBS của hai chủng vi khuẩn này do khác nhau về khả năng lên men loại đường Saccarose. Vi khuẩn V.alginolyticus có khả năng lên men đường
Saccarose làm thay đổi màu sắc của môi trường từ màu xanh sang màu vàng (Hình 4.4). Trong khi đó, vi khuẩn V.harveyi không có khả năng lên men loại đường này nên không làm thay đổi màu sắc của môi trường (Hình 4.5).
Kết quả phân lập không thấy sự có mặt của các loài vi khuẩn khác, điều này cho thấy hai chủng vi khuẩn phân lập được là tác nhân chính gây bệnh trên tôm thẻ chân trắng. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu của D. Lightner (1996) khi phân lập các tác nhân gây bệnh viêm ruột trên tôm sú nuôi ở Philippin, ông cũng bắt gặp các loài V.harveyi, V.alginolyticus, V. parahaemolyticus trên các mẫu bệnh phẩm.
4.3. Kết quả thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược
Các thí nghiệm được tiến hành đối với vi khuẩn nuôi cấy ở mật độ 106
CFU/ml. Thảo dược thử nghiệm ở 4 nồng độ: 100%, 75%, 50%, 25%. Qua kết quả thử nghiệm thảo dược ở nồng độ 25%, tất cả thảo dược đều không có tác dụng kháng khuẩn (vi khuẩn mọc tràng đĩa). Đặc biệt đối với hai loại thảo dược diếp cá, rau má ở nồng độ 50% cũng không có tác dụng kháng khuẩn.
4.3.1. Khả năng kháng khuẩn của tỏi đối với các chủng vi khuẩn phân lập được
Kết quả thử nghiệm tác dụng tỏi lên sự phát triển V.alginolyticus,
Hình 4.4. Khuẩn lạc của vi khuẩn
V.alginolyticus trên môi trường TCBS
Hình 4.5. Khuẩn lạc của vi khuẩn
0 5 10 15 20 25 Tỏi 100% Tỏi 75% Tỏi 50 % Nồng độ thảo dược Đ ư ờn g kí nh v òn g kh án g kh uẩ n (m m ) a b c
Đồ thị 4.1. Khả năng kháng khuẩn của tỏi đối với V.alginolyticus
(a, b, c: Thể hiện sự khác biệt thống kê với p < 0.05)
0 5 10 15 20 25 30 Tỏi 100% Tỏi 75% Tỏi 50% Nồng độ thảo dược Đ ư ờn g kí nh v òn g kh án g kh uẩ n (m m )
b
a
c
Đồ thị 4.2. Khả năng kháng khuẩn của tỏi đối với V.harvey
Hình 4.6. Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của tỏi khi thử
nghiệm trên V.alginolyticus
Đối với vi khuẩn
V.alginolyticus, kết quả từ đồ thị 4.1 cho thấy tỏi ở 3 nồng độ: 100%, 75%, 50% đều có khả năng kháng khuẩn. Tỏi ở nồng độ 100% khả năng kháng khuẩn mạnh nhất với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình 20,4 ± 0.82 mm, tỏi ở nồng độ 50% kháng khuẩn kém nhất với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình 12,8 ± 2,41 mm. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p = 0,0060; 0,0006; 0,0031<0.05).
Đối với vi khuẩn Vibrio harvey,
qua đồ thị 4.2 chỉ rõ, tỏi nguyên chất và tỏi pha loãng 75%, 50% đều có khả năng kháng khuẩn. Tỏi ở các nồng độ khác nhau cho khả năng kháng khuẩn khác nhau. Tỏi nguyên chất có khả năng kháng khuẩn tốt nhất với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 22,1 ± 3,11mm, tỏi 75% kháng khuẩn kém hơn với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 18,6 ± 1,95mm, thấp nhất ở tỏi nồng độ 50% với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 12,9 ± 1,52 mm. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.
Mức độ kháng khuẩn của thảo dược được quyết định bởi thành phần, tính chất của các hợp chất được chiết xuất. Theo Đỗ Tất Lợi, 2004, trong tỏi có một ít iốt và tinh dầu. Thành phần chính của tỏi có chứa một hợp chất kháng sinh
Hình 4.7. Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của tỏi khi thử nghiệm trên
có tên alixin C6H10OS2, một hợp chất sunfua có tác dụng diệt vi khuẩn rất mạnh. Trong tỏi không có chất alixin ngay mà có chất aliin, một loại axit amin, chất aliin chịu tác dụng của men alinaza cũng có trong tỏi mới tạo thành alixin.
Chất alixin tinh khiết không màu, hòa tan trong cồn, benzen, ete, không ổn định trong nước, dễ thủy phân. Độ thủy phân chừng 2,5%. Điều này giải thích vì sao tỏi nồng độ 75%, 50% có tác dụng kháng khuẩn kém hơn tỏi nguyên chất.
Chất alixin bị nhiệt sẽ chóng mất tác dụng, gặp kiềm cũng bị mất tác dụng. Chất alixin rất dễ mất oxy do đó mất tác dụng kháng sinh, vì vậy nhiều tác giả đã cho rằng tác dụng kháng sinh của alixin chủ yếu do oxy trong phân tử.
Chất alixin rất dễ kết hợp với một axit amin cystein có gốc SH để tạo thành một hợp chất khác. Gốc SH có tính chất kích thích sự sinh sản của vi sinh vật hay tế bào. Do đó tỏi có ức chế sự sinh sản của vi khuẩn bằng cách phá hoại khâu SH của chất cystein.
4.3.2. Khả năng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) đối với các
chủng vi khuẩn phân lập được
Kết quả thử nghiệm tác dụng hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) lên sự phát triển của các chủng vi khuẩn phân lập được thể hiện qua đồ thị 4.3 và đồ thị 4.4.
0 5 10 15 20
(Tỏi+ húng) 100% (Tỏi+húng) 75% (Tỏi+húng) 50%
Nồng độ thảo dược Đ ư ờn g kí nh v òn g kh án g kh uẩ n (m m )
b
a
b
Đồ thị 4.3. Khả năng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) đối với V.alginolyticus
(a, b: Thể hiện sự khác biệt thống kê với p < 0.05)
0 5 10 15 20
(Tỏi+ húng) 100% (Tỏi+húng) 75% (Tỏi+húng) 50%
Nồng độ thảo dược Đ ư ờn g kí nh v òn g kh án g kh uẩ n (m m )
b
ab
a
Đồ thị 4.4. Khả năng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) đối với V.harvey
Hình 4.8. Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng khi
thử nghiệm trên V.alginolyticus
Kết quả từ đồ thị 4.3 chỉ rõ đối với vi khuẩn V.alginolyticus, hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) ở 3 nồng độ đều có khả năng kháng khuẩn. Hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) nồng độ 100% khả năng kháng khuẩn mạnh nhất với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 16,3 ± 1,30 mm, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) nồng độ 75% hiệu quả kháng khuẩn cao hơn hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) nồng độ 50%. Tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa về thống kê (p = 0,138 > 0,05). Hay nói
cách khác khả năng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) nồng độ 75% tương đương hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) nồng độ 50%.
Đối với vi khuẩn V.harveyi, qua đồ thị 4.4 cho thấy hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) ở 3 nồng độ đều có khả năng kháng khuẩn. Hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) nồng độ 100% có khả năng kháng khuẩn cao nhất với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 13,7 ± 1,09 mm, kém nhất hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) nồng độ 50% với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 11,7 ± 1,79 mm. Sự khác biệt giữa hai nồng độ này có ý nghĩa thống kê (p = 0,035 < 0,05). Khả năng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) nồng độ 50% kém hơn hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) nồng độ 100% nhưng tốt hơn hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) nồng độ 50%. Tuy nhiên, sự khác biệt giữa nồng độ này với hai nồng độ còn lại không có ý nghĩa về thống kê (p > 0,05).
Thành phần hóa học của lá húng chứa ít tinh dầu (0,05 - 0,12%), trong tinh dầu có đến 65,2% các hợp chất phenolic trong đó có salicylat, thymol, carvacrol, eugenol và chavicol. Các thành phần này có tác dụng diệt khuẩn. Trong lá húng còn có một chất màu đỏ có tên colein. Colein trong lá có tác dụng kháng sinh mạnh đối với một số vi khuẩn.
Theo Nguyễn Anh Tuấn, 2008 hợp chất tỏi, lá húng có tác dụng kháng khuẩn
Aeromonas sp phân lập được từ mẫu cá trắm cỏ bị bệnh nhiễm khuẩn. Như vậy, tỏi và lá húng có tác dụng diệt khuẩn đối với cả vi khuẩn nước ngọt và nước lợ, mặn.
4.3.3. Khả năng kháng khuẩn của diếp cá đối với các chủng vi khuẩn phân lập được được
Khả năng kháng khuẩn của diếp cá đối với các chủng vi khuẩn phân lập được thể hiện qua bảng 4.3 và 4.4.
Bảng 4.3. Khả năng kháng khuẩn của diếp đối với V.alginolyticus
Nồng độ thảo dược Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) MS±SD
100% 7,2±0,57a
75% 5,1±1,02b
(a, b: Thể hiện sự khác biệt thống kê với p<0,05)
Bảng 4.4. Khả năng kháng khuẩn của diếp cá đối với Vibrio harvey
Nồng độ thảo dược Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) MS ± SD
100% 7,4 ± 0.82a
75% 5,1 ± 0,74b
(a, b: Thể hiện sự khác biệt thống kê với p<0,05)
Đối với V.alginolyticus, kết quả bảng 4.3 thể hiện rõ diếp cá ở nồng độ 100% , 75% đều có khả năng kháng khuẩn. Ở nồng độ 100% hiệu quả kháng khuẩn của diếp cá cao hơn với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 7,2±0,57 mm, ở nồng độ 75% khả năng kháng khuẩn của diếp cá thấp hơn với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 5,1 ± 1,02 mm. Sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê(p = 0,004 < 0,05).
Đối với V.harveyi, qua bảng 4.4 thấy rõ diếp cá nồng độ 100% và 75% có khả năng kháng khuẩn. Diếp cá nồng độ 100% kháng khuẩn mạnh hơn diếp cá nồng độ 75%. Đường kính vòng kháng khuẩn trung bình lần lượt ở hai nồng độ 7,4 ± 0.82; 5,1 ± 0,74. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p = 0,001< 0,05.
Theo Đỗ Tất Lợi, 2004, trong cây diếp cá có chừng 0,0049 % tinh dầu, một ít chất ancaloit có tên cocdalin. Thành phần chủ yếu của tinh dầu có chứa mertylnonylxeton CH3CO(CH2)8CH3 (có mùi rất khó chịu), chất miêcxen C10H46, axit caprinic C9H19COOH và laurinaldehyt. Hoa quả chứa chất isoquexitrin và không chứa quexitrin. Những hợp chất này có tính kháng khuẩn mạnh, đặc biệt đối với nhũng vi khuẩn gây bệnh trên người.
4.3.4. Khả năng kháng khuẩn của rau má đối với các chủng vi khuẩn phân lập được được
Kết quả thử nghiệm tác dụng rau má lên sự phát triển V.alginolyticus, V.harveyi được thể hiện bảng 4.5 và 4.6.
Bảng 4.5. Khả năng kháng khuẩn của rau má đối với Vibrio alginolyticus
Nồng độ thảo dược Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) MS ± SD
100% 6,6 ± 0,96a
75% 4,9 ± 0,89b
Bảng 4.6. Khả năng kháng khuẩn của rau má đối với Vibrio harvey
Nồng độ thảo dược Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) MS±SD
100% 6,9 ± 1,14a
75% 5,4 ± 0,96b
(a,b: Thể hiện sự khác biệt về mặt thống kê với p < 0,05)
Đối với vi khuẩn V.alginolyticus, kết quả từ bảng 4.5 thể hiện rõ khả năng kháng khuẩn của rau má ở nồng độ 100% và nồng độ 75%. Rau má nồng độ 100% tiêu diệt vi khuẩn mạnh hơn rau má nồng độ 75%. Với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình lần lượt 6,6 ± 0,96 mm, 4,9 ± 0,89 mm. Sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê với p = 0,01< 0,05.
Đối với vi khuẩn V.harveyi, qua bảng 4.6 thấy rõ, rau má nồng độ 100% và 75% đều có khả năng kháng khuẩn. Hiệu quả kháng khuẩn khi thử nghiệm nồng độ 100% tốt hơn 75%. Với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình lần lượt 6,9 ± 1,14 mm, 5,4 ± 0,96 mm. Sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê với p = 0,027 < 0,05.
Rau má được nhiều người nghiên cứu nhưng kết quả chưa thống nhất. Theo Basu và Lamsal (1947), trong rau má có một ancaloit hydrocotylin C22H33O8N, có độ nhạy 210 - 2120C. Ancaloit này cho các muối oxalat với độ chảy 2950C, muối picrat với độ chảy 110 - 1120C, muối cloroplatinat với độ chảy 134 - 1360C. Theo Bửu Hội, Rakoto Ratsimamaga và Boiteau, trong cây rau má có chứa một glucozit có tên asiaticozit sẽ cho
axit aisiatic và glucoza. Chất glucozit này có tinh thể, tan trong rượu, độ chảy 230-2330C, có thể cho một dẫn xuất tan trong nước gọi là oxyasiaticozit. Chất này có khả năng kháng khuẩn. Một số tác giả khác (Lythoe và Trippet) nghiên cứu rau má đã chiết xuất được một glucozit khác đặt tên là xentelozit có tính chất gần giống như aisiaticozit.
Theo y học cổ truyền, rau má có vị đắng, hơi ngọt, tính bình. Có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, sát trùng. Từ những năm 1940, y học hiện đại bắt đầu nghiên cứu những tác dụng của rau má. Rau má có những hoạt chất thuộc nhóm
