pH có ảnh hưởng lớn đến quá trình lên men. Thông thường độ pH của dịch quả nằm trong khoảng 2,8- 3,8. Nhưng pH thích hợp cho môi trường lên men là 4,0- 4,5. Nấm men có thể phát triển trong môi trường có pH từ 2,0- 8,0 nhưng vẫn thích hợp nhất là 4,0- 4,5. Vì vậy, trong lên men rượu người ta thường lên men ở pH 3,8- 4,0 để ngăn ngừa khả năng nhiễm vi khuẩn. Vì vi khuẩn bắt đầu phát triển ở pH 4,2. Tuy nhiên, trong thực tế có những loài vi khuẩn quen dần với pH thấp nên ngoài việc ứng dụng điều chỉnh pH thích hợp còn phải kết hợp sử dụng thuốc sát trùng. Ở mức pH 8,0 thì nấm men phát triển rất kémngược lại vi khuẩn phát triển rất mạnh. Để tạo pH thích hợp trong môi trường nuôi cấy nấm men (kể cả lên men) người ta có thể bổ sung vào trong môi trường bất cứ loại acid nào, miễn là anion của acid không gây ảnhhưởng mạnh đến trung tâm hoạt động của nấm men.
2.6.5 Ảnh hưởng của nồng độ rượu tạo thành
bào nấm men, tuy nhiên tùy theo nồng độ. Thông thường, nấm men lên men đến nồng độ rượu đạt 12- 14%. Một số ít nấm men có thể lên men đạt nồng độ rượu 17- 20%. Với nồng độ rượu cao hơn sẽ ức chế nấm men và kìm hãm lên men rượu.
2.6.6 Ảnh hưởng của CO2
Hàm lượng CO2 hình thành trong quá trình lên men thường hạn chế mạnh sự sinh sản của nấm men rượu vang. CO2 như là một chất trao đổi, trong nồng độ xác định nó có tác dụng kìm hãm hoặc làm ngừng sinh sản của nấm men. Theo nghiên cứu của Miuler-Thurrau, khi:
Hàm lượng CO2 trong rượu vang đạt 0,25% trọng lượng thì việc sinh sản của nấm men đình trệ.
Hàm lượng CO2 trong rượu vang đạt 1,5% trọng lượng thì nấm men không còn sinh sản được nữa.
(Bùi Ái, 2003)
2.7 VI SINH VẬT TRONG RƯỢU
Vi khuẩn có thể phát triển trong rượu là vi khuẩn acid acetic và acid lactic và 2 loại này đòi hỏi cần phải có oxy. Vi khuẩn acetic cần có oxy để phát triển và chuyển thành giấm trong khi vi khuẩn acid lactic phát triển tốt trong điều kiện hàm lượng oxy thấp. Trong nước quả, ngoài nấm men còn có nhiều loại vi khuẩn. Vi khuẩn khó nghiên cứu hơn nấm men vì kích thước nhỏ hơn nấm men nhiều. Chỉ gần đây nhờ có kính hiển vi điện tử mới biết rõ thêm về cấu trúc của chúng. Nấm men chuyển đường thành rượu, gây một sự thay đổi có ích, còn vi khuẩn thì tác động đến nhiều thành phần của nước quả hay của rượu, chuyển thành các chất có hại làm cho rượu có vị chua, vị đắng, có mùi hôi …
2.7.1 Hư hỏng do vi khuẩn acetic
Rượu vang để tiếp xúc rộng rãi với không khí chỉ sau vài tuần bị một màng trắng bao phủ đó là màng giấm. Vi khuẩn giấm biến rượu etylic thành acid acetic, do đó rượu vang có mùi giấm. Một phần nhỏ acid acetic lại hợp với rượu etylic thành một este, etyl acetate và chất này có mùi chua gắt, khó chịu hơn cả giấm. Người ta nếm rượu căn cứ vào mùi etyl acetate để đánh giá rượu có bị chua giấm hay không. Phản ứng tạo thành giấm
C2H5OH + O2 = CH3COOH + H2O
Tuy nhiên, Peynaud cho rằng mùi chua giấm là do etyl acetate, một este được hình thành bởi vi khuẩn acetic
Một số vi khuẩn lên men giấm sản xuất ra nhiều etyl acetate hơn những sản phẩm khác, etyl acetate có thể bị mất do sự bay hơi trước khi lên men và hòa vào trong rượu.
Vi khuẩn giấm phát triển mạnh hay yếu, tùy thuộc các nhân tố sau đây:
- Số lượng khuẩn ban đầu, do đó phải tìm cách lọc, giữ vệ sinh để giảm lượng này và rất khó loại hoàn toàn
- Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn. Ví dụ lượng acid acetic hình thành ở 280C cao gấp đôi ở 230C
- Độ pH cũng ảnh hưởng lớn, rượu càng chua vi khuẩn giấm càng khó sinh sản, ví dụ dưới pH 3,2 rất ít khi thấy xuất hiện vi khuẩn giấm
- Polyphenol - tanin có tác dụng kìm hãm (nhẹ)
- Các vitamin ảnh hưởng cũng như đối với vi khuẩn lactic, cần thiết nhất là acid pantothenic, nicotinamic, đôi khi thiamin (B1)
- Vi khuẩn giấm cần rất nhiều oxy. Ví dụ muốn tăng acid bay hơi 0,8 g trong một lít rượu vang, vi khuẩn phải có tối thiểu 2 lít không khí. Vì vậy, giữ rượu vang trong chai, lọ nút kín, không cho tiếp xúc với không khí là cách tốt nhất để chống bệnh chua giấm.
Vì có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của men giấm nên mặc dù có vi khuẩn nhưng không nhất thiết rượu vang nào cũng bị bệnh chua giấm.
2.7.2 Hư hỏng do vi khuẩn acid lactic
2.7.2.1 Sinh thái khuẩn lactic
Loại vi khuẩn này có thể hiện diện ở bất cứ nơi đâu như trên nguyên liệu, trong xưởng rượu trên các dụng cụ chế rượu cũng có. Không phải tất cả các vi khuẩn này đều có thể tồn tại. Do một số không thể sinh sản được vì pH quá thấp, có độ cồn tăng lên dần thì khuẩn bị ức chế. Cuối cùng chỉ có một tỉ lệ rất thấp các khuẩn có mặt ở quả lúc đầu sống sót và sau này gây lên men malolactic (biến acid malic thành acid lactic), nhờ thích ứng được dần dần với điều kiện môi trường có cồn chúng sinh sản rất chậm sau một thời gian tiềm sinh. Cần chú ý là trong quá trình lên men, điều kiện không thuận cho vi khuẩn lactic tăng dần, nhất là khi người ta cho thêm các men với số lượng lớn. Tế bào nấm men đông hơn, thích hợp với cồn, với pH thấp hơn nên chiếm hết thức ăn của vi khuẩn, và khi cho thêm SO2 vào lại thuận cho nấm men hơn là cho vi khuẩn vì nấm men chịu đựng giỏi hơn. Như vậy lên men malolactic bắt đầu không muộn hơn lên men rượu, nhưng bị kìm hãm dần lại và chỉ diễn ra thực sự vài ngày hoặc vài tuần sau khi lên men rượu xong và là kết
2.7.2.2 Hoạt động của khuẩn lactic
Trong tự nhiên, lên men lactic diễn ra như nói trên, ngay những giờ đầu sự lên men lactic bắt đầu nhưng sau đó ngừng lại vì vi khuẩn lactic bị rượu etylic hình thành ức chế. Sau khi lên men rượu xong chỉ còn một số ít vi khuẩn, 2/3 số rượu thăm dò có khoảng trên 10000 vi khuẩn/cc trong khi phải có khoảng 1.000.000 thì acid malic mới bị phân hủy đáng kể. Sau một thời gian tiềm sinh từ vài ngày đến vài tuần lễ, số lượng vi khuẩn lactic tăng dần, quá trình lên men malolactic mới bắt đầu. Sau khi acid malic bị phân hủy hết thì số lượng vi khuẩn lactic lại giảm.
Các yếu tố ảnh hưởng đến khuẩn lactic
- Độ pH có ảnh hưởng lớn: pH thích hợp cho vi khuẩn lactic là 4,2-4,5, nhưng ở độ pH này, vi khuẩn lactic thường là vi khuẩn que (lactobacillus) có khuynh hướng phân hủy không phải acid malic mà là đường, acid tatric... làm hỏng rượu. Nếu pH thấp 3,5-3,2 thì vi khuẩn hoạt động rất khó khăn và chỉ còn sống sót một số vi khuẩn cầu (Leuconostoc)
- Nhiệt độ tác động đến vi khuẩn cũng giống như đối với nấm men. Nhiệt độ thích hợp nhất là vào khoảng 25-300C. Tuy nhiên nhiệt độ lên tới 300C khi lượng rượu etylic đã cao thì vi khuẩn lactic có thể bị diệt. Vì vậy khi lên men malolactic giữ rượu ở 20-250 thích hợp
- Yêu cầu đối với oxy: Người ta thường cho khuẩn lactic yếm khí, trái với khuẩn giấm háo khí. Thực ra khuẩn lactic có thể chịu được yếm khi nhưng nếu có oxy hòa tan trong nước thì hoạt động có phần tốt hơn khi hoàn toàn yếm khí
- Yêu cầu đối với acid amin: Mỗi loài vi khuẩn có những yêu cầu nhất định đối với từng loại acid amin.Ví dụ như yêu cầu của vi khuẩn cầu cao hơn vi khuẩn que về mặt này
- Yêu cầu đối với cac vitamin: Cũng như nấm men, vi khuẩn cần có những vitamin nhất định ở trong môi trường và về mặt này yêu cầu của vi khuẩn que lại cao hơn vi khuẩn cầu. Acid pantothenic và nicotinic nói chung cần thiết cho đa số khuẩn; Riboflavin (B2), acid folic và đôi i khi thiamin (B1) hoặc cần thiết hoặc có tinh chất kích thích tùy theo loại khuẩn.
2.7.2.3 Kết quả hoạt động của khuẩn lactic lên men malolactic và các bệnh rượu
- Lên men malolactic, vi khuẩn lactic gây nên những sự thay đổi trong rượu đa số là có hại, chỉ có một sự thay đổi có ích như biến acid malic thành acid lactic. Acid malic trong công thức có 2 nhóm –COOH, acid lactic có một nhóm –COOH, nên khi biến acid malic thành acid lactic giảm độ chua được một nữa, rượu dịu đi. Ngoài ra, acid malic có vị chua gắt, khó chịu, còn acid lactic có vị mềm hơn
- Lên men malolactic không cung cấp năng lượng cho vi khuẩn lactic cho nên vi khuẩn lại phải phân hủy các thành phần khác của rượu để lấy năng lượng. Vì vậy không có khuẩn lactic nào hoàn toàn có ích cả. Thực ra, người ta phân biệt hai nhóm vi khuẩn lactic, nhóm thứ nhất bao giờ cũng nguy hiểm vì phân hủy các thành phần khác của rượu nhiều hơn là phân hủy acid malic, nhóm thứ hai thường chỉ quen phân hủy acid malic và là vi khuẩn có ích và chỉ có hại trong những điều kiện đặc biệt.
Trong quá trình chế biến rượu, khi theo dõi lên men rượu, đồng thời cũng phải theo dõi lên men malolactic. Phải phân tích định kỳ đều đặn độ chua tổng cộng, acid bay hơi, lượng acid malic. Khi nào hết acid malic thì gạn cặn, lọc để loại bớt vi khuẩn, nếu cần tiệt trùng.
Trong rượu vang, ảnh hưởng của vi khuẩn lactic chỉ có lên men malolactic là tăng chất lượng của vang. Những biến đổi khác do vi khuẩn lactic gây ra đều có hại vì phá hủy các thành phần cơ bản của vang, làm cho vang bị bệnh. Các loại bệnh trong rượu vang thường gặp:
Bệnh vang dính (vins filants): Khi rót rượu ra cốc vang không chảy đều, lỏng như nước mà dính như có hồ nếp. Đó là do khuẩn lactic nhất là loại Leuconostoc, trong những điều kiện nhất định, tiết ra quanh mình một loại đường riêng gọi là dextran. Bệnh này thường kéo theo bệnh chua tatric và bệnh vang đắng..
Bệnh chua lactic (piqure lactique): Xảy ra khi trong rượu vang còn lại đường khử, chưa chuyển hết thành rượu. Đường khử bị khuẩn lactic phá hủy chuyển thành đường manit và acid bay hơi, gây một mùi chua khó chịu. Là một bệnh phổ biến của rượu vang, xảy ra khi quả quá ngọt hoặc cho thêm quá nhiều đường, kỹ thuật lên men thấp, làm cho men ngừng hoạt động nửa chừng hoặc do cấy men chưa đủ, lượng nhiệt quá cao.
Bệnh chua tatric (tourne): Xảy ra khi khuẩn lactic phá hủy acid tartric làm cho rượu đục, tiết nhiều CO2, rượu chuyển màu nâu, có vị nhạt...
Bệnh đắng: Xảy ra khi men lactic phá hủy glycerin. Rượu trở thành chua, có vị đắng do các chất acrolein hình thành.
2.8 CHITOSAN
Chitosan là một polymer sinh học được điều chế từ chitin, một thành phần quan
trọng của vỏ tôm, cua có nhiều ứng dụng trong bảo quản thực phẩm do khả năng
kháng khuẩn của nó. Chitosan là một polysaccharide, được hình thành từ quá trình
tách gốc acetyl của chitin bằng cách xử lý xút đặc. Chitosan được phát hiện lần đầu
trong các acid hữu cơ, thông thường dùng acid acetic nên chitosan có nhiều ứng
dụng hơn chitin. (Struszyk, M.H., 2002)
2.8.1 Cấu trúc hóa học của chitin
Chitin là polysaccharide mạch thẳng, có thể xem như là dẫn xuất của cellulose, trong đó nhóm (-OH) ở nguyên tử C(2) được thay thế bằng nhóm acetyl amino (- NHCOCH3) (cấu trúc I). Như vậy chitin là poly (N-acety-2-amino-2-deoxi-b-D- glucopyranozơ) liên kết với nhau bởi các liên kết b-(C-1-4) glycosid. Trong đó các mắt xích của chitin cũng được đánh số như của glucose:
Hình 2.6 Cấu trúc hóa học của chitin
(Nguồn: www.hoahocvietnam.com)
2.8.2 Cấu trúc hóa học của chitosan
Chitosan là dẫn xuất đề acetyl hoá của chitin, trong đó nhóm (–NH2) thay thế nhóm (-COCH3) ở vị trí C(2). Chitosan được cấu tạo từ các mắt xích D-glucozamin liên kết với nhau bởi các liên kết b-(1-4)-glicozit, do vậy chitosan có thể gọi là poly b- (1-4)-2-amino-2-deoxi-D-glucozơ hoặc là poly b-(1-4)-D- glucozamin (cấu trúc III).
Hình 2.7 Cấu trúc hóa học của chitosan
2.8.3 Đặc tính của chitosan
Chitosan có một số đặc tính sau:
- Là một polymer sinh học có hoạt tính cao, màu trắng hay vàng nhạt
- Không tan trong nước, dịch kiềm hay acid đậm đặc nhưng tan trong acid loãng (pH 6) tạo dung dịch keo trong
- Nhiệt độ nóng chảy 309- 3110C
- Độc tính thấp (LD50 = 16g/kg thể trọng)
- Có tính kháng nấm, kháng khuẩn và có khả năng tự phân hủy sinh học cao - Không gây dị ứng, không gây độc hại cho người và gia súc
- Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm chức mà trong đó các nguyên tử oxi và nitơ của nhóm chức còn cặp electron chưa sử dụng, do đó chúng có khả năng tạo phức, phối trí với hầu hết các kim loại nặng và các kim loại chuyển tiếp như: Cu(II), Ni(II), Co(II)… Tùy nhóm chức trên mạch polymer mà thành phần và cấu trúc của phức khác nhau
- Khi tạo thành màng mỏng có tính bán thấm - Công thức phân tử của chitosan là ( C6H11O4N)n - Phân tử lượng của chitosan M = 161x n.
2.8.4 Một số ứng dụng của chitosan
Một trong những ứng dụng của chitosan là làm chất trợ lắng trong công nghệ sản xuất nước ép quả (đặc biệt là các loại nước quả có độ đục cao như nước ép táo, nước bưởi ép, nước nho ép…) làm chất ổn định trạng thái của sản phẩm dạng paste từ trái cây như paste táo, paste xoài, paste mãng cầu,…Vì thế, việc nghiên cứu sử dụng chitosan làm chất trợ lắng trong công nghệ sản xuất rượu vang chuối xiêm thay thế cho các tác nhân trợ lắng thông thường như gelatin, pectin, gum,… nhằm làm trong rượu vang chuối. Ngoài tác dụng làm trong, chitosan còn được dùng để bảo quản trái cây, bảo quản thực phẩm do có khả năng tạo màng, hạn chế mất nước,
kháng khuẩn, kháng nấm. Ngoài ra, do có khả năng tạo phức với một số kim loại
chuyển tiếp nên chitosan được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: như xử lí nước thải, bảo vệ môi trường, dược học, y học, nông nghiệp, công nghiệp công nghệ sinh học,…
2.9 QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU VANG CHUỐI XIÊM
Sản phẩm rượu vang chuối xiêm được sản xuất theo quy trình sau:
Chuối xiêm (bóc vỏ, xắt lát)
Chần (800C, thời gian ghi nhận ở thí nghiệm 1)
Bổ sung enzyme
Alpha amylase (880C; pH 6,4; 0,02%, 50-70ppm Ca2+) Glucoamylase (540C; pH 4,4; 0,03%)
Phối chế
(Điều chỉnh pH 4,3; 0Brix 22)
Bổ sung nấm men (theo nồng độ tối ưu)
Lên men chính (12 ngày)
Lọc thô
Lên men phụ
Chiết dịch
Xay nhuyễn (tỷ lệ chuối 1: nước 4)
Thanh trùng (NaHSO3 122mg/lít)
Sản phẩm
CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1 PHƯƠNG TIỆN
3.1.1 Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2 Thời gian thực hiện
3 tháng kể từ ngày nhận đề tài (03/02 đến 03/05/2009) 3.1.3 Dụng cụ thí nghiệm - Cân điện tử - Nhiệt kế - pH kế - Chiết quang kế - Cồn kế. Một số dụng cụ cấn thiết khác. 3.1.4 Thiết bị thí nghiệm Hình 3.1 Máy chà thịt quả Hình 3.2 pH kế - Bể điều nhiệt - Nồi nấu - Bếp gas
- Nồi cô đặc chân không - Máy chà thịt quả
- Máy quang phổ tử ngoại khả khiến U2800, Hitachi, Nhật.
3.1.5 Các hóa chất sử dụng - H2O2 - Guaiacol - Acid citric - Natri Bisulfit - Phenolphtalein - Chitosan
Và một số hóa chất dùng để chuẩn độ methanol, aldehyde, ester, acid.
3.1.6 Nguyên liệu
- Chuối xiêm chín