Rosini và al (1982), phân loại lại mơi trƣờng của các chủng nấm men của viện vi sinh học của trƣờng Đại học Perouse, đã quan sát, trên 591 chủng S.cerevisiae
bảo quản malt thạch, 23 trƣờng hợp mất khả năng lên men galactose, điều đĩ cĩ nghĩa là 23 chủng này trở nên bayanus theo sự phân loại của Lodder (1970). Sử dụng các phƣơng pháp di truyền đồng nhất nấm men trong lên men rƣợu vang, nhanh và thƣờng đƣợc sử dụng, sự khuếch đại thành các đoạn của gen đơn bội bởi phản ứng poly hĩa mạch (PCR), gần đây đã chỉ ra rằng một dụng cụ tuyệt vời của
19
sự phân biệt của lồi lên men vang. Dƣới đây là một số lồi đƣợc phân loại theo nghiên cứu trên.
Bảng 2.3: Một số chủng nấm men saccharomyces cerevisiae[1]. Chủng nấm
men
Đặc điểm Khả năng ứng dụng
trong lên men
Chủng 12. Tế bào trịn hình
trứng với kích thƣớc 5-8. Nhiệt độ 250C chỉ trong vịng một ngày cụ thể tạo thành bào tử (1 – 4 bào tử).tế bào già thƣờng chứa nhiều glycogen và metaxromatin.
Sinh sản mạnh trong 12 giờ đầu nuơi cấy sau đĩ chậm dần
Khả năng lên men rất mạnh glucose, matose, fructose, galactose, saccharose, maltose và 1/3 rafinose.
Khi lên men cĩ khẳ năng tích lũy trong mơi trƣờng 13% đƣờng. Chủng số 2 (do Linder tách ra từ 1889 trong nhà máy rƣợu). Tế bào dài, hình đứng, lớn và sinh sản bằng cách nảy chồi. Ở 25oC trong 30 giờ nuơi cấy cĩ thể tạo thành bào tử (thƣờng trong tế bào cĩ 3 bào tử) Chủng đầu tiên đƣợc ứng dụng trong sản xuất rƣợu Lên men đƣợc các loại đƣờng nhƣ chủng 12 nhƣng khả năng sinh sản kém hơn. Chủng M.10 (đƣợc tách từ năm1916). Tế bào chủng này cĩ hình trịn hay hình oval với kích thƣớc 5-6 x 6-7µ.
Chúng cĩ khả năng sản sinh rất nhanh.
Sản xuất các loại nguyên liệu chứa đƣờng.
Lên men đƣợc ở nồng độ rất cao.
Bền vững với acid sulfuric và tồn tại đƣợc ở pH =2.
20
Chủng B. Tế bào hình trụ, hình oval với kích thƣớc tế bào 3,9-9,7 x 39-8,9 .
Sử dụng rộng rãi trong sản xuất rƣợu từ mật rỉ.
Cĩ khả năng lên men rƣợu rất tốt, đồng thời cĩ đặc tính lên men bánh mì cao. Chủng M (thu đƣợc vào 1905) do Ghenebec. Bền và ổn định, thích nghi đƣợc những điều kiện khơng bình thƣờng trong thực tế sản xuất.
Sinh sản nhanh và hiệu suất lên men tƣơng đối tốt
Lên men trong mơi trƣờng chứa các hỗn hợp đƣờng khác nhau.
2.4.Cơ sở khoa học của quá trình lên men rƣợu.
Quá trình lên men là quá trình phức tạp trong đĩ cĩ sự biến đổi quan trọng trong hoạt động trao đổi chất của nấm men. Quá trình chuyển hĩa nguồn nguyên liệu thành sản phẩm chính trong lên men rƣợu là ethanol và CO2, ngồi ra trong quá trình lên men cịn tạo ra nhiều sản phẩm hữu cơ khác cĩ khả năng ảnh hƣởng tới chất lƣợng của rƣợu vang. Do đĩ hiểu rõ những cơ sở khoa học trong quá trình lên men sẽ giúp cho việc điều khiển quá trình lên men xảy ra theo chiều hƣớng cĩ lợi.
21
Hình 2.4.1: Quá trình chuyển hĩa glucose trong tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae [6].
Quá trình lên men rƣợu thực chất là một quá trình chuyển hĩa đƣờng thành rƣợu etylic, CO2 và các sản phẩm phụ khác.Quá trình chuyển hĩa từ đƣờng hexose đến rƣợu etylic và CO2 cĩ thể biểu diễn theo phƣơng trình tổng quát của Gay-Lussac [5].
22
Hình 2.4.2: Quá trình chuyển hĩa glucose thành ethanol [31]. C6H12O6 2 C2H5OH + 2CO2 + Q
Theo phƣơng trình thì khi lên men sẽ tạo ra 2 phân tử rƣợu etylic và 2 phân tử CO2. Theo lý thuyết thì hiệu suất thu hồi rƣợu là 51,1% so với hexose và 53,8% đối với maltose hoặc saccharose[5]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Năm 1857, Louis Pasteur đã cơng bố kết quả nghiên cứu của mình và kết luận: Sự phân giải đƣờng thành rƣợu và CO2 trong điều kiện yếm khí, cứ 100% glucose sẽ tạo thành 51,1% C2H5OH và 49,4% CO2, 3,2 acid succinic và khoảng 1% các sản phẩm khác[39].
Quá trình lên men đƣợc thực hiện qua một chuỗi phản ứng rất phức tạp và liên quan đến quá trình phosphoryl hĩa các hợp chất hữu cơ. Tồn bộ quá trình này đƣợc thơng qua chu trình Embden-Meyerhof. Trong đĩ, đáng chú ý là sự tham gia của ATP trong quá trình chuyển hĩa glucose thành rƣợu etylic:
C6H12O6 + 2ATP + 2H3PO4 + 4ADP 2C2H5OH + 2CO2 + 2ADP + 4ATP Năng lƣợng tích lũy trong liên kết ATP chính là nguồn năng lƣợng cung cấp cho hoạt động của nấm men. Và đây cũng là nguồn năng lƣợng làm tăng nhiệt độ của dịch lên men trong quá trình lên men.Xét về mặt hĩa học, sự lên men rƣợu cĩ thể chia thành 2 thời kì: thời kì cảm ứng và thời kì tĩnh.
Thời kì cảm ứng:
Ở giai đoạn này, chất nhận H của enzyme alcohol-dehydrgenase là acetaldehyde đƣợc tạo chƣa đầy đủ. Do đĩ, enzyme sẽ chuyển H đến cho andehyde phophateglycerinic. Dƣới tác dụng của enzyme phosphatase, phosphateglycerin bị
23
thủy phân để tạo thành glycerin. Nhƣ vậy trong mơi trƣờng sẽ hình thành glycerin và CO2.
Thời kì tĩnh:
Đến lúc này, lƣợng acetaldehit là cơ chất bình thƣờng của enzyme alcohol- dehydrogenase đƣợc tạo thành đã cĩ nhiều, nên enzyme sẽ chuyển H đến cho cơ chât của nĩ, rƣợu etylic và CO2 đƣợc hình thành từ đây.
Trong mơi trƣờng acid, glycerin là sản phẩm phụ chỉ đƣợc tạo ra trong thời kì cảm ứng.Thực tế cho thấy rằng, sự lên men chỉ xảy ra một cách bình thƣờng cho sản phẩm chủ yếu là rƣợu và một số sản phẩm phụ khác nhƣ glycerin, acid hữu cơ, chỉ trong điều kiện pH của mơi trƣờng từ 4-5 và mơi trƣờng yếm khí, sự lên men xảy ra mới mạnh mẽ nhƣng khi đĩ sự phát triển của nấm men cĩ thể bị kìm hãm, do điều kiện yếm khí nên lƣợng Oxy khơng cung cấp đủ cho quá trình gia tăng sinh khối. Khi cĩ khơng khí thì sự lên men sẽ yếu dần đi và nấm men thu nhận năng lƣợng của cần thiết để phát triển theo con đƣờng hơ hấp hiếu khí bằng cách oxy hĩa glucose để chuyển thành CO2 và H2O. hiện tƣợng kìm hãm sƣ lên men rƣợu dƣới ảnh hƣởng của oxy đƣợc gọi là hiệu ứng pasteur[5].
Con đƣờng chuyển hĩa từ đƣờng glucose đến sản phẩm ethanol theo chuỗi phản ứng của chu trình EMP(Embden-Meyerhof pathway) và chi phối bởi các enzyme pyruvate decarboylase và enzyme alcohol dehydrogenase:
24
2.5.Các yếu tố ảnh hƣởng đến nấm men Saccharomyces cerevisiae trong quá trình lên men rƣợu.
2.5.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ :
Trong cơng nghiệp lên men yếu tố nhiệt độ đƣợc đánh giá là nhân tố quan trọng từ khi bắt đầu đến khi kết thúc quá trình lên men. Ngày nay đã cĩ rất nhiều nghiên cứu xem xét tác động của nhiệt độ đối với quá trình lên men. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra nhiệt độ tối ƣu trong quá trình lên men của nấm men saccharomyces là khoảng 28 – 320C. Tuy nhiên nếu bắt đầu lên men ở nhiệt độ thấp thì khả năng lên men sẽ cao và kéo dài hơn. Ở nhiệt độ 300C nấm men thuần phát triển nhanh hơn Saccharomyces 2 – 3 lần, cịn ở nhiệt độ 35 -380C chúng phát triển nhanh gấp 6 đến 8 lần. Khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều ester, aldehyde và tổn thất rƣợu theo CO2 sẽ tăng.
Hình 2.5.1: Tác động của nhiệt độ lên mật độ tế bào: (□) 15oC, (◊)20oC,(●) 25oC, (∆) 30oC, (▼) 35o
25
Nhiệt độ cĩ tác động đến những quá trình trao đổi chất của tế bào và đặc tính của nấm men trong quá trình tạo ra lƣợng ethanol( Bảng: 2.4 ). Điều này yêu cầu sự hiểu biết trong việc tìm hiểu những chủng nấm men đáp ứng yêu cầu và sự kiểm sốt nhiệt độ phụ thuộc những quá trình sinh lý học khác nhau, và chiều hƣớng thay đổi sự trao đổi chất của nấm men. Việc lên men ở nhiệt độ thấp trở thành một ứng dụng quan trọng trong cơng nghiệp sản xuất rƣợu vang, một mặt nào đĩ nĩ cĩ tác dụng đến quá trình sinh trƣởng của tế bào, bởi vì chúng làm tăng khả năng chịu stress của nấm men trong suốt quá trình lên men.
Bảng 2.4: Tác động của điều kiện nhiệt độ lên các sản phẩm của quá trình lên men [28]. Nồng độ(g/l) 15oC 20oC 25oC 30oC 35oC Ethanol 93.60±0.56 93.04±0.88 90.00±0.00 89.60±0.00 79.52±0.08 Glycerol 6.05±0.11 6.59±0.07 6.91±0.11 7.18±0.02 7.38±0.08 Acetaldehyde 0.05±0.00 0.09±0.01 0.04±0.00 0.04±0.00 0.02±0.00 Acid Succinic 0.74±0.06 0.89±0.04 0.77±0.06 0.92±0.08 0.70±0.03 Acid Acetic 0.08±0.01 0.13±0.01 0.14±0.00 0.13±0.01 0.22±0.04 Tổng sản phẩm 100.52 100.74 97.86 97.87 87.84 CO2 89.53 88.99 86.08 85.70 76.06 Tổng sản phẩm+ CO2 190.05 189.73 183.94 183.57 163.90 Ethanol nấm menα 47.51 47.23 45.68 45.48 40.36
α : ethanol tạo thành(g/l) x 100/ nồng độ đƣờng ban đầu(g/l).
Sự ảnh hƣởng trong quá trình lên men ở chế độ nhiệt độ thấp chính là sự kéo dài trong pha lag và điều này thúc đẩy nhiều nghiên cứu nhằm rút ngắn quá trình này đĩ là sử dụng những chủng nấm men khơ qua quá trình làm ƣớt. Những phân tích ở cấp độ phân tử đã cho thấy những minh chứng về khả năng tế bào nấm men thích ứng với những điều kiện stress sau khi cĩ sự biến đổi đột ngột về nhiệt độ[11]. Việc lên men tại những điều kiện nhiệt độ khác nhau dẫn đến sự sinh trƣởng của nấm men cũng hồn tồn khác nhau.Việc sử dụng chửng Saccharomyces cerevisiae EC1118 ở diều kiện nhiệt độ là 15oC và 30oC đã cho thấy những thay đổi đáng kể của nấm men với các điều kiện stress về nhiệt độ. Một trong những tác động cĩ ảnh hƣởng lớn nhất tới quá trình lên men ở nhiệt độ thấp là là sự ảnh hƣởng
26
của quá trình trao đổi Nitơ. Mặc dù trong suốt quá trình đã đƣợc cung cấp 1 hàm lƣơng amoniac là nhƣ nhau nhƣng kết quả cho thất lƣợng sinh khối tạo ra ở 15o
C ít hơn lƣợng sinh khối tạo ra ở 30oC và các chủng nấm men cơng nghiệp biểu hiện tốt hơn so với chủng nấm men trong phịng thí nghiệm.
Bảng 2.5 : Sự tác động của yếu tố nhiệt độ lên quá trình lên men rƣợu trên chủng Saccharomycescerevisiae.
Nhiệt độ Tác động cĩ lợi trong lên men
Tác động cĩ hại trong lên men
28-32oC Khoảng nhiệt độ tối ƣu cho quá trình lên men rƣợu[5,11].
Tổn thất do tạo men khá cao. Ở 29,5o
C là 7,37%[2]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
32-35oC Thời gian lên men nhanh, hàm lƣợng sản phẩm phụ cao tăng giá trị
tạo hƣơng vị cho sản phẩm[5].
Lƣợng tế bào chết tăng, mất cân bằng. Hoạt tính nấm men giảm theo thời gian[5].
20-22oC Hạn chế tạp khuẩn trong mơi trƣờng lên men.
Tổn thất trong quá trình lên men vẫn cịn ở mức cao.
10-18oC Ổn định chất lƣợng sản phẩm, tăng giá trị cảm quan cho sản
phẩm[3,11,7].
Tổn thất do tạo men giảm dần khi giảm nhiệt độ lên men ở 17,5oC là 5,32%, ở 10oC là 4,42%[2].Yếu tố nguy hại cĩ thể tồn tại ở mức độ cao[11].
4oC Ổn định chất lƣợng sản phẩm. Giữ đƣợc hƣơng vị đặc trƣng cho sản
phẩm trong khi bảo quản[19].
Nấm men hầu nhƣ khơng phát triển trong điều kiện nhiệt độ lạnh. Nấm men chỉ đƣợc phát hiện sau 50 giờ lên men[19].
27
Hình 2.5.2: Sự sinh trƣởng của nấm men S. cerevisiea S228C trong mơi trƣờng YPD ( độ hấp thụ) theo ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau: (♦), 35o
C; (○), 25oC; (■), 15oC; (▲), 4o
C [19].