Phƣơng pháp ABC là phƣơng pháp IHC chuẩn và là một trong những kỹ thuật đƣợc sử dụng rộng rãi trong việc nhuộm màu. Avidin, một glycoprotein lớn, có thể đƣợc đánh dấu bằng peroxidase hoặc fluorescent và có ái lực cao đối với biotin. Biotin, một vitamin có trọng lƣợng phân tử thấp, có khả năng tiếp hợp với nhiều phân tử sinh học khác nhau nhƣ là kháng thể
Kỹ thuật này liên quan đến 3 lớp. Lớp thứ nhất là kháng thể sơ cấp không đánh dấu. Lớp thứ hai là kháng thể thứ cấp đƣợc gắn với biotin. Lớp thứ ba là một
phức hợp của avidin – biotin peroxidase. Sau đó peroxidase đƣợc gắn bởi DAB hay các cơ chất khác để tạo những sản phẩm cuối cùng có màu sắc khác nhau.(Hình 2.7.D)
2.5.4.5. Phƣơng pháp đánh dấu Streptavidin Biotin (LSAB)
Streptavidin, có nguồn gốc từ streptococcus avidini, là một phƣơng thức
mới nhằm thay thế avidin. Phân tử streptavidin không có điện tích trên mô của động vật, không giống nhƣ avidin có điểm đẳng điện là 10 và do đó loại bỏ đƣợc sự gắn kết tĩnh điện với mô. Thêm vào đó, streptavidin không chứa các nhóm carbohydrate nên không gây ra sự gắn kết với mô lectin.
LSAB là kỹ thuật tƣơng tự nhƣ kỹ thuật ABC chuẩn. lớp đầu tiên là kháng thể sơ cấp không đánh dấu. Lớp thứ hai là kháng thể sơ cấp đƣợc đánh dấu bằng biotin. Lớp thứ ba là phức hợp enzyme và streptavidin (HRP – Streptavidin hoặc AP – Streptavidin) để thay thế cho phức hợp avidin – biotin peroxidase. Enzyme đƣợc quan sát bằng dung dịch chất tạo sắc để tạo ra những sản phẩm cuối có màu sắc khác nhau. Lớp thứ ba có thể đƣợc đánh dấu bằng fluorescent dye – streptavidin nhƣ FITC – streptavidin. (Hình 2.7.E)
Theo một số báo cáo gần đây cho rằng phƣơng pháp LSAB có độ nhạy cao hơn 5 – 10 lần so với phƣơng pháp ABC chuẩn
PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THÍ NGHIỆM 3.1.1. Thời gian 3.1.1. Thời gian
Từ ngày 6/3/2006 đến ngày 18/7/2006
3.1.2. Địa điểm
- Gây nhiễm: Trại Thực Nghiệm Thuỷ Sản Thủ Đức-Tp HCM
- Phân tích IHC: Phòng Mô Học – Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trƣờng và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Khu Vực Nam Bộ – Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II.
3.2. VẬT LIỆU
3.2.1. Vật liệu và dụng cụ sử dụng trong quá trình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn 3.2.1.1. Vật liệu 3.2.1.1. Vật liệu
- Dịch virus gốc sử dụng trong thí nghiệm đƣợc tạo từ dòng WSSV-VN thu từ khu vực bệnh đốm trắng tại Long An năm 2003. Sau đó tăng sinh và tinh sạch tại Đại học Ghent – Vƣơng quốc Bỉ.
- Tôm sú có độ tuổi từ 45 ngày tuổi (trọng lƣợng cơ thể 8,5 g 2) đƣợc lấy từ trại nuôi tôm Công ty K22, huyện Thạnh Phú, tỉnh Bến Tre sau khi đã kiểm tra tôm không mang các mầm bệnh virus thông thƣờng (WSSV, MBV, IHHNV, HPV, YHV, TSV). Tôm đƣợc đem về Trại Thực Nghiệm Thuỷ sản Thủ Đức, nuôi thuần dƣỡng theo các điều kiện thí nghiệm 6 ngày trƣớc khi đƣa vào gây nhiễm thực nghiệm.
- Bể kính thí nghiệm có thể tích 126 lít
- Nƣớc biển sử dụng trong thí nghiệm đƣợc chở từ Vũng Tàu có độ mặn 30 %o- 35 ‰ đƣợc pha loãng đến 20 ‰ cho thí nghiệm. Sau đó xử lý nƣớc biển bằng chlorine 30 ppm. Sau 3 ngày trung hòa dƣ lƣợng chlorine.bằng NaHSO4.
3.2.1.2. Dụng cụ
- Micropipette 100µl, 1000µl; eppendoff 2ml; găng tay; kim tiêm insulin; bông gòn tiệt trùng
- Máy bơm nƣớc, sục khí, đá bọt, bộ lọc cơ. - Vợt và thức ăn tôm lớn CP – 9003 P - Panh, dao, kéo vô trùng
- Hóa chất: Cồn 700, cồn 900, dung dịch Davidson, nƣớc cất, dung dịch đệm PBS, Chlorine, formaline, NaHSO4.
3.2.2. Các hóa chất và dụng cụ sử dụng trong IHC 3.2.2.1. Hóa chất 3.2.2.1. Hóa chất
- Xylene
- Ethanol ( 100 %, 95 %, 70 %, 50 %) - Sodium azide 10 %
- Tris NaCl, tris HCl pH 7.6 - H2O2 30%
- Kháng thể thứ nhất 8B7 (Diagxostic – USA)
- Kháng thể thứ hai (Anti-mouse Ig, biotinylated species-specific whole antibody (Amersham – Vƣơng quốc Anh)
- Normal Sheep serum (Calbiochem)
- Streptavidin – biotine horseradish peroxidase (HRP) (Amersham – Vƣơng quốc Anh)
- 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (Sigma – USA) - Hematoxylin
- Keo dán Baume Canada
3.2.2.2. Vật tƣ - Lame - Lame - Lamella - Găng tay - Khẩu trang - Kim - Kẹp - Bình tam giác
- Các loại becher, ống đong
3.2.2.3. Thiết bị
- Tủ lạnh - Máy ủ nhiệt - Máy xử lý mẫu
- Máy cắt mẫu microtome - Tủ ủ
- Kính hiển vi quang học
3.3. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
3.3.1. Tôm và điều kiện thí nghiệm
Tôm sau khi đƣợc nuôi thuần hóa trong bể composite 4 ngày đƣợc chuyển lên các bể kính thí nghiệm chứa 70 lít nƣớc biển có độ mặn 20 ‰ và nhiệt độ nƣớc là 280C, pH nƣớc 7,5 – 8,5 đƣợc duy trì suốt quá trình thí nghiệm. Tiến hành 2 thí nghiệm. Ở thí nghiệm thứ nhất, tôm (n = 48) đƣợc tiêm với liều thấp và ở thí nghiệm thứ hai tôm (n = 48) đƣợc tiêm với liều cao. Trong mỗi thí nghiệm, mỗi nhóm 6 con tôm đƣợc nuôi chung trong 1 bể thí nghiệm chứa 70 lít nƣớc. Tôm thí nghiệm đƣợc cho ăn mỗi ngày 3 lần: 8; 13 và 18 giờ.
Các chỉ tiêu môi trƣờng đƣợc theo dõi:
Chỉ tiêu lần 1 lần 2
Trong ngày:
Nhiệt độ 8 giờ 14 giờ
pH 8 giờ 14 giờ
Oxy hoà tan 8 giờ 14 giờ
Đầu và cuối đợt thí nghiệm
Amonia Đầu thí nghiệm Cuối thí nghiệm
3.3.2. Virus đốm trắng dòng Việt Nam (WSSV-VN)
Stock virus đốm trắng dòng Việt Nam sau khi chuẩn độ có đƣợc nồng độ gây nhiễm 50 % số tôm thí nghiệm (SID50/ml) là 105,32 SID50/ml. Từ 105,32 SID50/ml tiến hành pha loãng dịch virus trong PBS 1X để có đƣợc liều cao (104,0
SID50/ml) và liều thấp (101,5 SID50/ml). Thể tích tiêm cho liều thấp và liều cao là 100 l
3.3.3. Gây nhiễm virus đốm trắng trên tôm sú
Sử dụng kim tiêm insulin (1ml) hút 100 l dịch virus đã đƣợc pha loãng và tiêm thẳng vào phần cơ giữa đốt thứ 2 và thứ 3 ở mặt bên của tôm. Sau khi tiêm khử trùng chỗ tiêm bằng cồn 70 %.
3.3.4. Thời gian theo dõi và thu mẫu để khảo sát quá trình phát sinh bệnh
Thời gian theo dõi và thu mẫu nhƣ bảng 3.1 cho cả 2 thí nghiệm Mỗi lần thu mẫu là 6 con/bể và tiến hành trong 60 h
Bảng 3.1: Thời gian theo dõi và thu mẫu tôm sú để khảo sát quá trình phát sinh bệnh.
Bể 1 2 3 4 5 6 7 8 Đ/C Số tôm 6 6 6 6 6 6 6 6 6 Thời điểm Thu mẫu 0* 6 12 18 24 36 48 60 Kết thúc thí nghiệm (*): thu ở 0 giờ để xem hiệu quả tiêm
3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Phƣơng pháp pha loãng dịch virus 3.4.1. Phƣơng pháp pha loãng dịch virus
Cách tính để có đƣợc liều cao104,0 SID50/100 l thể tích tiêm (Nghĩa là 104,0 SID50/100 µl = 105,0 SID50/1ml) Cách tính: Hệ số pha loãng 105,32 SID50.ml-1 =100,32 = 2,089 lần 105 SID50.ml-1
Thể tích dịch virus cần để sử dụng để gây nhiễm thực nghiệm: 100µl x 6con x 8 bể = 4800 µl
Thể tích dịch virus đã đƣợc chuẩn độ SID50/ml cần sử dụng để pha loãng:
Vstock = Vsử dụng /hệ số pha loãng = 4800 l / 2,089 = 2297,7µl (2,2977 ml)
Thành phần dịch virus liều cao là: 2,2977 ml stock SID50/ml + 2,5023 ml PBS
Cách tính để có đƣợc liều thấp 101,5 SID50/100µl thể tích tiêm (nghĩa là
101,5 SID50/100 µl = 102,5 SID50/1ml Cách tính: Hệ số pha loãng: 105,32 SID50. ml-1 =102,82 lần = 660,69 lần 102,5 SID50. ml-1 Thể tích cần để sử dụng: 100µl x 6 x 8 bể = 4800 µl
Thể tích dịch virus đã đƣợc chuẩn độ SID50/ml cần sử dụng để pha loãng:
Vstock = Vsử dụng / hệ số pha loãng = 4800 l / 660,69 = 7,265 l Thành phần dịch virus liều thấp là: 7,265 l + 4792,735 l PBS
3.4.2. Phƣơng pháp thu mẫu tôm
Thu mẫu tôm phân tích PCR:
Thu chân bơi và 1 – 2 lá mang, cố định trong cồn 950 Thu mẫu tôm phân tích IHC
Ở mỗi thời điểm tiến hành thu phần đầu của 6 con, tiêm và cố định trong dung dịch Davidson từ 24 – 48 h, sau đó chuyển qua cồn 500 ít nhất là 24h. .
Sau đó tiến hành cắt mẫu nhƣ sau: - 3 con xẻ dọc
- 3 con còn lại đƣợc cắt ngang làm 3 phần riêng :
Phần 1: gồm ruột trƣớc, tuyến anten, biểu mô dƣới vỏ
Phần 2: phần giữa của phần đầu gồm ruột giữa, gan tụy, mang, dạ dày, mô tạo máu, lymphoid.
Phần 3: phần còn lại của đầu
3.4.3. Phƣơng pháp nhuộm IHC
Quy trình thực hiện IHC gồm 3 giai đoạn chính
Ủ mẫu trong 24 – 72 giờ
12,5 giờ
Làm lạnh
Ủ mẫu ở 400C
Quy trình 3.4: Các bƣớc thực hiện IHC
Thu mẫu
Cố định mẫu
Xử lý mẫu
Đúc mẫu
Cắt mẫu
Nhuộm IHC và quan sát dƣới kính hiển vi Chuyển mẫu lên lame
Giai đoạn 1: Xử lý mẫu (theo phƣơng pháp mô học)
Bước 1: Xử lý mẫu
Mẫu sau khi đƣợc cố định trong dung dịch Davidson đƣợc chuyển vào cassette và rửa 1 – 2 giờ dƣới vòi nƣớc. Sau đó xử lý theo quy trình 3.2. Quá trình này đƣợc thực hiện bằng máy. Tổng thời gian xử lý là 12,5 giờ
Quy trình 3.5: Các giai đoạn xử lý mẫu
Bước 2: Đúc mẫu
Cho mẫu vào nằm sát đáy khuôn, rót hỗn hợp paraffin vào đầy khuôn, đậy nắp cassette và để nguội.
Sau khi nến đông lại, đặt khuôn lên bàn lạnh cho đến khi tách đƣợc khối paraffin ra khỏi khuôn và đặt lên bàn lạnh cho đến khi mặt cắt cứng lại.
Bước 3: Cắt mẫu
Cắt khối paraffin chứa mẫu bằng máy cắt mẫu microtome. Bề dày lát cắt là 5 m.
Bước 4: Đính mẫu lên lame.
Với mỗi lát cắt, nhỏ cồn 70 % sao cho ƣớt toàn bộ lát cắt rồi chuyển vào nồi nƣớc nóng 400C. Dùng lame (+) vớt mẫu. Sau đó ủ ở 500C cho đến khi mẫu khô hoàn toàn. Cồn 70 % 30 phút Cồn 95 % (1) 30 phút Cồn 95 % (2) 30 phút Cồn 95 % (3) 30 phút Cồn tuyệt đối (1) 30 phút Cồn tuyệt đối (2) 30 phút Cồn tuyệt đối (3) 30 phút Chloroform (1) 1,5 giờ Chloroform (2) 1,5 giờ Paraffin (1) 3 giờ Paraffin (2) 3 giờ
Giai đoạn 2: Tiến hành nhuộm IHC cho mẫu
Quy trình 3.6: Các bƣớc thực hiện IHC
Bước 1: Khử paraffin cho mẫu mô
- Xylene 1 lần 5 phút
- Cồn 100 % 1 lần 5 phút
- Cồn 95 % 1 lần 5 phút
- Cồn 70 % 1 lần 5 phút
- Cồn 50 % 1 lần 5 phút
Nhúng 3 lần trong Tris buffer NaCl pH 7.6. Mỗi lần 5 phút
Bước 2: Ngăn ngừa hoạt động của enzyme nội bào
Ngăn hoạt động của enzyme peroxidase nội bào: Pha dung dịch gồm sodium azide (10 %), Tris - NaCl, H2O2 theo tỉ lệ 25 : 221 : 4. Lƣợng dung dịch cần pha phụ thuộc vào lƣợng lame muốn nhuộm (80μl hỗn hợp/lame). Dùng micropipette hút dung dịch và trải đều lên trên mặt mẫu.
Ủ mẫu 30 phút ở nhiệt độ phòng. Khử paraffin Ngăn hoạt động của enzyme nội bào bằng
SA 10% Ủ với kháng thể thứ nhất Ủ với kháng thể thứ hai Rửa 3 lần với Tris-NaCl 1X Rửa 3 lần với Tris-NaCl 1X Rửa 3 lần với
Tris-NaCl 1X Ủ với HRP Rửa 3 lần với
Tris-NaCl 1X
Hiển thị màu bằng DAB Nhuộm tạo màu nền
với hematoxylin Khử nƣớc Dán keo Baume Canada 30 phút Mỗi lần 5 phút 1 giờ Mỗi lần 3 phút 1 giờ Mỗi lần 3 phút 30 phút Mỗi lần 5 phút
Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (5 phút/lần).
Bước 3: Ủ với kháng thể thứ nhất
Pha kháng thể 8B7 mAb (kháng WSSV VP28) với huyết thanh cừu 10% (100 μl huyết thanh cừu + 900 μl tris buffer pH 7,6) theo tỉ lệ 1:30. Lƣợng dung dịch cần pha và cách sử dụng tƣơng tự bƣớc 3.
Ủ mẫu 1 giờ ở 370
C .
Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (3 phút/ lần).
Bước 4: Ủ với kháng thể thứ hai
Pha kháng thể thứ hai (kháng thể của cừu có gắn biotin kháng lại kháng thể 1 từ chuột) với huyết thanh cừu 10% (100 μl huyết thanh cừu + 900 μl tris buffer pH 7,6) theo tỉ lệ 1:200. Lƣợng dung dịch cần pha và cách sử dụng tƣơng tự bƣớc 3.
Ủ mẫu trong 1 giờ ở 370
C.
Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (3 phút/lần)
Bước 5: Ủ với Streptavidine-biotin HRP
Pha phức hợp streptavidine-biotinylated horseradise peroxidase với huyết thanh cừu 10% (100 μl huyết thanh cừu + 900 μl tris buffer pH 7,6) theo tỉ lệ 1:200. Lƣợng dung dịch cần pha và cách sử dụng tƣơng tự bƣớc 3.
Ủ mẫu trong 30 phút tại nhiệt độ phòng.
Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (5 phút/lần).
Bước 6: Làm hiển thị màu bằng DAB
Pha DAB trong Tris buffer pH 7,6 không có NaCl (0,5mg DAB/ml Tris buffer). Bổ sung ngay trƣớc khi dùng H2O2 (30 %) với tỉ lệ 3H2O2 : 5Tris buffer.
Nhúng lame mẫu vào dung dịch và ủ vài phút tại nhiệt độ phòng.
Kiểm tra sự hiện màu (màu nâu tích tụ trong tế bào nhiễm virus) trong phút đầu tiên sau khi nhúng lame vào dung dịch DAB. Dừng phản ứng bằng cách nhúng lame trong tris buffer pH 7,6 + NaCl.
Bước 7: Nhuộm tạo nền tƣơng phản bằng cách nhúng lame vài lần vào dung
dịch hematoxylin pha loãng.
Rửa cẩn thận với nƣớc cất 2 lần cho đến khi hết hematoxylin trên lamee.
Bước 8: Khử nƣớc
Ethanol 50% 1 lần 5 phút/lần. Ethanol 70% 1 lần 5 phút/lần.
Ethanol 95% 1 lần 5 phút/lần. Ethanol 100% 1 lần 5 phút/lần.
Xylene 1 lần 5 phút/lần.
Bước 9: Dán lamella với Baume Canada.
Lame sau khi lấy ra khỏi xylene để khô trong vài phút, nhỏ một giọt keo Baume Canada ngay trên tiêu bản mẫu, đặt lamella lên lame kính, tránh hiện tƣợng có bọt khí bên trong.
Giai đoạn 3: Đọc kết quả
Tiến hành đọc kết quả ở các vật kính 10X, 40X và 100X. Quan sát các tế bào nhiễm WSSV bị trƣơng nhân và bắt màu nâu trên các cơ quan: lympho, ruột giữa, gan tụy, tim, mang, mô tạo máu, ruột trƣớc, tuyến anten, dạ dày và biểu mô dƣới vỏ.
3.4.4. Xử lý thống kê
Sử dụng phần mềm thống kê Statgraphics 7.0 để so sánh cƣờng độ nhiễm của virus đốm trắng lên các cơ quan của tôm thí nghiệm ở 2 liều tiêm.
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 ĐỘC LỰC CỦA DÕNG WSSV-VN TRÊN TÔM SÖ 4.1.1. Kết quả theo dõi thực nghiệm
Bảng 4.1: Tỷ lệ phần trăm (%) tôm biểu hiện các dấu hiệu lâm sàng ở các thời điểm sau khi gây nhiễm
Liều
Thời điểm thu mẫu sau
khi tiêm (giờ) Hoạt động bất thƣờng (%) Bỏ ăn (%) Đỏ thân (%) Xuất hiện đốm trắng (%) Hấp hối (%) Chết (%) 101,5 SID50/ml 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 18 0 0 0 0 0 0 24 0 0 0 0 0 0 36 66.7 0 16.7 0 0 0 48 83.3 83.3 16,7 0 0 0 60 100 100 16.7 16.7 0 16.7 104,0 SID50/ml 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 18 0 0 0 0 0 0 24 33.3 33.3 0 0 0 0 36 66.7 33.3 0 0 0 0 48 33.3 66.7 16.7 0 0 0 60 100 100 50 100 16.7 16.7 Đ/C 0 0 0 0 0 0
Hình 4.1: Tôm bị nhiễm virus đốm trắng
A: Tôm bị đỏ thân (a: đỏ thân; b: đối chứng) B: xuất hiện đốm trắng trên vỏ đầu ngực.( )
Nhận xét
- Các biểu hiện bất thƣờng của tôm thí nghiệm ở liều thấp xuất hiện vào thời điểm 36 giờ sau khi gây nhiễm, trong khi đó ở liều cao xuất hiện vào thời điểm 24 giờ sau khi gây nhiễm. Điều này chứng tỏ nồng độ virus càng cao thì khả năng gây nhiễm và khả năng lan truyền của chúng trong cơ thể vật chủ càng nhanh (Bảng 4.1).
- Khi kết thúc thí nghiệm, tỷ lệ tôm chết do virus đốm trắng ở cả 2 liều thấp và cao là 16,7 %. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả chuẩn độ virus đốm trắng WSSV- VN. Kết quả này chứng minh rằng trong khoảng thời gian 60 giờ sau khi gây nhiễm độc lực của virus đốm trắng WSSV-VN không đủ để xác định đƣợc LD50 (yêu cầu số lƣợng tôm chết > 50 %)
4.1.2. Tỷ lệ nhiễm WSSV-VN của tôm thí nghiệm bằng IHC theo thời gian