II. Thu nhận enzymeprotease từ nấm mốc Aspergillus oryzae
2.2.2.Thuyết minh quy trình
1. Quy trình thu nhận enzyme protease
2.2.2.Thuyết minh quy trình
a. Môi trường
Mục đích: Chuẩn bị môi trường cho nuôi cấy cho phép vi sinh vật phát triển tốt
Sử dụng enzyme thô Nuôi cấy Chế phẩm thô Bã Trích ly Thức ăn chăn nuôi Kết tủa enzyme Ly tâm Thu nhận kết tủa Sấy Nghiền và bảo quản Chế phẩm enzyme
Cách tiến hành: Nguồn tinh bột như cám gạo, chứa khoảng 20% tinh bột, 10- 20% chất béo, 10–14% protein, 8 – 16% cellulose, các chất hòa tan không chứa nitơ 37– 59%.Cám không được chứa hàm lượng tinh bột dưới 20%, không có vị chua hay đắng, không hôi mùi mốc, độ ẩm không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%, có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ ((NH4)2SO4, (NH4)2CO), photpho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu. Các phụ phẩm thêm vào để thoáng khí cho môi trường nuôi cấy bề mặt như trấu , mùn cưa
b. Nuôi cấy
Mục đích: Tạo điều kiện tối ưu cho vi sinh vật phát triển và sinh enzyme
Cách tiến hành: Sau khi đã trộn giống, môi trường được rải đều ra các khay với chiều dài 2 -3cm, rồi được vào phòng nuôi cấy, đặt trên các giá đỡ. Các giá đỡ này được thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên. Phòng nuôi cấy phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí, nhiệt độ thích hợp cho sợi nấm phát triển là từ 280C – 32oC. Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp đều ảnh hưởng đến sự phát triển của sợi nấm.
Trong quá trình nuôi cấy ta không cần phải điều chỉnh pH. Môi trường bán rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít ảnh hưởng đến cả khối môi trường
Thời gian nuôi sợi nấm thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ. Điều này còn phụ thuộc vào chủng mốc Asp. oryza, điều kiện môi trường cùng như kĩ thuật nuôi cấy
Thiết bị: Khay nuôi cấy bề mặt
Thông số kĩ thuật: + Dày 4-5cm + Cao 1-1,2m
Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài từ 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Ở giai đoạn này có những thay đổi sau như nhiệt độ tăng rất chậm, sợi nấm bắt đầu hình thành có màu trắng hoặc màu sữa, thành phần chất dinh dưỡng cũng bắt đầu thay đổi, khối môi trường còn rời rạc, enzyme mới bắt đầu được hình thành. Trong giai đoạn này không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kì đầu giống rất mẫn cảm với nhiệt độ.
Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài từ 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau: Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và phát triển mạnh tạo thành những mạng chằng chịt bao quanh các hạt môi trường, có thể nhìn rõ sợi nấm màu trắng xám bằng mắt thường, môi trường kết lại khá chặt, độ ẩm môi trường giảm dần, nhiệt độ môi trường có thể tăng nhanh lên 40-500C, các chất dinh dưỡng giảm nhanh do sự đồng hóa của sợi nấm, enzyme prorease được tổng hợp mạnh, lượng O2 trong không khí giảm và lượng CO2 tăng dần, cần phải thông khí mạnh và duy trì mức nhiệt độ từ 29-300C là tốt nhất.
Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài từ 10-20 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi như sau. Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ tiêu hao chất dinh dưỡng sẽ giảm lại, nhiệt độ của môi trường giảm, lượng enzyme tạo ra sẽ giảm xuống. Do đó cần xác định thời gian để thu nhận enzyme hiệu quả nhất.
c. Chế phẩm thô
Mục đích: Thu được chế phẩm enzyme protease, chế phẩm này được gọi là enzyme thô vì ngoài thành phần enzyme chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước.
Cách tiến hành: Để đảm bảo enzyme không bị mất hoạt tính nhanh người ta thường sấy enzyme đến một độ ẩm thấp (Thường dùng là máy sấy chân không).Nhiệt độ sấy vào khoảng 38-400C,enzyme protease bị mất hoạt tính ở 60-760C, độ ẩm sau khi kết thúc sấy nhỏ hơn 10%.
Tùy thuộc vào mục đích sử dụng mà ta có thể sử dụng ngay enzyme này mà không cần phải tinh sạch. Trong những trường hợp khác ta phải tiến hành tinh sạch enzyme để bảo quan lâu hơn.
d. Trích ly
Mục đích: Tách enzyme ra khỏi khối môi trường.
Cách tiến hành: Sau khi nghiền mịn người ta cho nước vào để trích ly enzyme. Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta sử dụng chúng như dung môi hòa tan. Cứ 1 phần chế phẩm thô cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ và lọc lấy dịch, phần bã được loại bỏ để làm thức ăn cho gia súc.
Thiết bị: Thiết bị trích ly kiểu thùng quay
Hình 2.4. Máy trích ly
Thông số kĩ thuật: + Nhiệt độ trích ly 250C + Thời gian 40-60 phút
e. Kết tủa enzyme
Mục đích: Thu nhận dung dịch enzyme
Cách tiến hành: Trong công nghiệp tinh chế enzyme người ta sử dụng cồn hoặc sunfatmon. Trong quá trình này người ta làm lạnh cả dung dịch thô và các tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính của enzyme. Cứ 1 phần dung dịch enzyme thô cho 2-2.5 phần cồn hoặc sunfat amon, cần nhẹ nhàng để tránh hiện tượng biến tính, khuấy nhẹ và để trong điều kiện lạnh từ 4-70Ctrong một thời gian, các enzyme tạo thành kết tủa và lắng xuống, người ta thu nhận kết tủa (Độ ẩm > 70%). Người ta tiếp tục sấy kết tủa ở 400C và độ ẩm giảm xuống 5-8%.
Hình 2.5. Thiết bị kết tủa
Thông số kĩ thuật:
+ Nhiệt độ:tiến hành ở nhiệt độ phòng + Muối:amoni sunfat 80%
+ Thời gian: 10-18 giờ + Hoạt độ riêng: 162 IU/mg + Hiệu suất: 74% (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
f. Ly tâm
Mục đích : Tách sinh khối vi sinh vật và bã của canh trường
Các biến đổi:Sự thay đổi về thể tích, khối lượng riêng, nhiệt độ của dung dịch, sự thay đổi hàm lượng chất khô và chất hòa tan trong 2 pha rắn-lỏng, tách huỳnh phù ra thành 2 pha rắn-lỏng
Các yếu tố ảnh hưởng: Sự chênh lệch khối lượng riêng của 2 pha rắn lỏng:chênh lệch nhiều thì quá trình diễn ra dễ dàng hơn, tốc độ quay của roto: Tốc độ càng nhanh quá trình diễn ra càng tốt.
Hình 2.6. Thiết bị ly tâm lắng
Thông số công nghệ:
+ Tốc độ quay 10000 rpm +Thời gian 10 phút
+ Nhiệt độ 40C
+ Hoạt độ riêng 80.1IU/mg + Độ tinh sạch: 1
i. Hệ thống sấy phun
Mục đích: Tách nước ra khỏi dung dich mà không làm thay đổi tính chất của enzyme nhằm bảo quản lâu hơn.
Các yếu tố ảnh hưởng: Nồng độ chất khô của nguyên liệu, nồng độ cao làm giảm thời gian bốc hơi, tăng độ nhớt của nguyên liệu gây khó khăn cho quá trình sấy phun. Nồng độ thấp làm tốn nhiều thời gian và năng lượng cho quá trình. Nhiệt độ sấy lưu ý đến nhiệt độ biến tính của enzyme để điều chỉnh nhiệt độ sấy thích hợp.
Hình 2.7. Thiết bị sấy phun
Thông số kĩ thuật: + Nhiệt độ: 30-3000C
+ Điện thế: 380V-50Hz-3 pha + Điều kiện: Chống quá nhiệt + Chế độ làm việc: Liên tục