Hình 4.5 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp đối chứng.
Biến nạp chỉ có tế bào khả nạp không có plasmid ( thể tích là 30μl tế bào khả nạp) phục hồi trong 800μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(100μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC.
Hình 4.6 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp ở tỉ lệ thể tích là 30 : 3.
Hình 4.7 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp ở tỉ lệ thể tích là 10 : 1.
Hình 4.8 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp ở tỉ lệ thể tích là 3 : 0.5.
Biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích(μl) là 30 :3 phục hồi trong 800μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(100μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37o
C
Biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 10 :1 phục hồi trong 500μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(100μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37o
C.
Biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 3 :0.5 phục hồi trong 200μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(100μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37o
Với nồng độ kháng sinh 100µg/ ml, đĩa đối chứng không xuất hiện khuẩn lạc nào. Trên cơ sở này tiến hành đánh giá các tỉ lệ biến nạp.
Kết quả chọn lọc thể biến nạp ở nồng độ kháng sinh 100µg/ ml(Hình 4.6, 4.7, 4.8) cho khuẩn lạc xanh với mật độ rất cao, điều này cho thấy đây là nồng độ phù hợp để chọn lọc các khuẩn lạc mong muốn.
Biến nạp ở thể tích 30µl khả nạp và 3µl plasmid cho kết quả ở giữa đĩa chỉ toàn khuẩn lạc xanh và các khuẩn lạc trắng chỉ có ở xung quanh đĩa. Điều này có thể giải thích do trong quá trình làm thí nghiệm đã có những xảy ra làm cho một số tế bào tự bản thân nó có khả năng kháng lại với kháng sinh, thao tác trang X-gal không đều ở xung quanh đĩa, do đó các tế bào đã tiếp nhận plasmid nhƣng không có X-gal để phân huỷ vì vậy chỉ cho khuẩn lạc trắng, tế bào đã tiếp nhận plasmid nhƣng quá trình phục hồi và biểu hiện của gen lacZ diễn ra chậm. Đối với các khuẩn lạc này khi quan sát kĩ sẽ thấy màu xanh nhạt
Tổng số khuẩn lạc xanh đếm đƣợc trên đĩa là 450, nhƣ vậy theo công thức tính hệ số biến nạp do Sambrook và cộng sự đƣa ra, chúng tôi tính đƣợc hệ số biến nạp ở tỉ lệ này là 3,073x103CFU/ μg plasmid.
Kết quả biến nạp ở thể tích 10µl khả nạp và 1µl plasmid xuất hiện cả khuẩn lạc xanh và trắng với mật độ tƣơng đƣơng nhau. Điều này chỉ có thể giải thích là do các tế bào bị đột biến kháng kháng sinh. Số khuẩn lạc xanh đếm đƣợc trên đĩa là 150, hệ số biến nạp ở tỉ lệ này là 1,9x103CFU/ μg plasmid.
Kết quả biến nạp ở thể tích 3µl khả nạp và 0.5µl plasmid chỉ thu đƣợc toàn khuẩn lac màu xanh, đây là kết quả tốt nhất trong các quy trình biến nạp mà chúng tôi đƣa ra. Theo chúng tôi thì tỉ lệ giữa khả nạp và plasmid trong quy trình này là phù hợp nhất và chúng tôi sẽ dựa vào tỉ lệ này để làm các bƣớc tiếp theo trong thí nghiệm. Số khuẩn lạc xanh đếm đƣợc trên đĩa là 180, hệ số biến nạp ở tỉ lệ này là 1,846x103CFU/ μg plasmid.
Nhƣ vậy, sau 3 lần lập lại thí nghiệm với các tỉ lệ biến nạp khác nhau, chúng tôi thu đƣợc hệ số biến nạp nằm trong khoảng từ 1,8-3,0x103CFU/ μg plasmid.