Chọn ở mỗi tỉ lệ biến nạp trong mục 4.2 năm khuẩn lạc cấy chuyền sang ống nghiệm chứa 5 ml môi trƣờng LB lỏng với nồng độ kháng sinh 100μg/ml, nuôi cấy lắc
ở 370
C qua đêm, cả 15 ống nghiệm trên đều có sinh khối vi khuẩn.Tiến hành tách chiết plasmid, thu đƣợc kết quả nhƣ sau :
Hình 4.9 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 0.8% (lần 1).
Mẫu số 1, 2, 3, 4, 5 : sản phẩm tách chiết plasmid từ khuẩn lạc thu được khi biến nạp ở tỉ lệ 30 :3 ; Mẫu số 6, 7, 8, 9, 10 : sản phẩm tách chiết plasmid từ khuẩn lạc thu được khi biến nạp ở tỉ lệ 10 :1 ; Mẫu số 11, 12, 13, 14, 15 : sản phẩm tách chiết plasmid từ khuẩn lạc thu được khi biến nạp ở tỉ lệ 3 :0.5, điện di ở hiệu điện thế 100V, thời gian 20 phút.
Trong 15 mẫu tách chiết, mẫu số 3, 5, 7, 15 mặc dù vi khuẩn phát triển đƣợc trên môi trƣờng có kháng sinh nhƣng không thu đƣợc plasmid. Kết quả bƣớc đầu chiết tách plasmid còn lẫn rất nhiều DNA của bộ gen. Các mẫu không thu đƣợc plasmid có thể do sai sót trong quá trình tách chiết plasmid. Chiết tách DNA plasmid còn lẫn DNA của bộ gen là do khi thêm dung dịch III vào để lâu nên cả DNA plasmid và DNA của bộ gen đều hoàn tính. Qua kết quả tách chiết trên tính đƣợc tỉ lệ tế bào tiếp nhận plasmid là 11/15.
Với nhận định trên chúng tôi tiến hành chiết tách plasmid lần 2 để khẳng định lại quy trình. Kết quả đƣợc thể hiện ở Hình 4.10. Kết quả chiết tách plasmid 5 mẫu, mẫu số 4 không thu đƣợc plasmid. Ở lần tách chiết này đã loại đƣợc DNA genome Tuy nhiên còn lẫn rất nhiều tạp chất, lỗi này có thể do khi thực hiện bƣớc 7 và bƣớc 8 trong quy trình tách chiết, chúng tôi đã để cho các tạp chất lẫn vào phần dịch nổi phía trên. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục tiến hành tách chiết lần 3 với mong muốn xác nhận những nghi ngờ của mình. Kết quả tách chiết lần 3 (có chú ý khắc phục những sai sót khi thực hiện ở lần tách chiết thứ 1 và thứ 2) đƣợc thể hiện ở Hình 4.11. Tiến hành tách chiết plasmid 5 mẫu, cả 5 mẫu đều có plasmid. Trong sản phẩm thu đƣợc không còn lẫn tạp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 DNA genome DNA plasmid 3.0kb
chất, chỉ thu đƣợc toàn plasmid. Nhƣ vậy, đây là quy trình tách chiết plasmid chuẩn, mọi sai sót xảy ra đều có thể khắc phục. Kết quả tách chiết chủ yếu phụ thuộc nhiều vào thao tác, hoá chất sử dụng đơn giản.
Hình 4.10 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 0.8% ( lần 2).
(DC) plasmid đối chứng, mẫu 1, 2, 3, 4, 5 là sản phẩm tách chiết plasmid của các khuẩn lạc từ tỉ lệ biến nạp theo thể tích giữa tế bào khả nạp và plasmid là 3 : 0.5, điện di ở hiệu điện thế 100V, thời gian 30 phút.
Hình 4.11 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 0.8% ( lần 3).
(DC) plasmid đối chứng, mẫu 1, 2, 3, 4, 5 là sản phẩm tách chiết plasmid của các khuẩn lạc từ tỉ lệ biến nạp theo thể tích giữa tế bào khả nạp và plasmid là 3 : 0.5, điện di ở 100V trong 30 phút.
Qua 3 lần tách chiết, chúng tôi đã hoàn thiện đƣợc quy trình tách chiết plasmid từ vi khuẩn E.coly biến nạp, kết quả tách chiết không còn lẫn DNA genome và các tạp
DC 1 2 3 4 5 1 2 DC 3 4 5 DNA plasmid 3.0kb DNA plasmid 3.0kb
50
chất khác. Sản phẩm tách chiết có thể dùng để thực hiện phản ứng cắt với enzym cắt giới hạn, đây là cơ sở để kiểm tra kết quả biến nạp.
Những điểm cần lƣu ý khi chiết tách plasmid :
Khi thêm dung dịch III vào phải ly tâm ngay nếu không DNA của bộ gen sẽ phục hồi cấu trúc vì vậy trong sản phẩm plasmid chiết tách sẽ có lẫn DNA của bộ gen.
Ở bƣớc 7 và 8 trong quy trình tách chiết, sau khi ly tâm xong phải lấy ra nhẹ nhàng và cẩn thận hút phần dịch nổi bên trên không đƣợc hút xuống phần bên dƣới.