Hình 4.3 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp khi sốc nhiệt 90 giây.
(a) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 30 :3 phục hồi trong 800μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC.(b) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 10 :1 phục hồi trong 500μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37o
C.(c) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 3 :0.5 phục hồi trong 200μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37o
C.(DC) biến nạp chỉ có tế bào khả nạp không có plasmid ( thể tích là 30μl tế bào khả nạp) phục hồi trong 800μl môi trường LB lỏng,cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37o
C. . b a c DC
Hình 4.4 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp khi sốc nhiệt 60 giây.
(a) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích(μl) là 30 :3 phục hồi trong 800μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X- gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37o
C.(b) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 10 :1 phục hồi trong 500μl môi trường LB lỏng,cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37o
C.(c) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 3 :0.5 phục hồi trong 200μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC.(DC) biến nạp chỉ có tế bào khả nạp không có plasmid ( thể tích là 30μl tế bào khả nạp) phục hồi trong 800μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37o
C.
Kết quả biến nạp trong 90 giây với tỉ lệ khả nạp : plasmid là 30 : 3 ; 10 : 1 ; 3 : 0.5 và đối chứng đƣợc thể hiện trên hình 4.3. Với kết quả biến nạp này cho thấy có một lƣợng khả nạp tiếp nhận đƣợc plasmid và thể hiện đƣợc đặc tính chọn lọc trên môi
a b
trƣờng LB/Amp/X-gal/IPTG, nhƣ vậy tế bào khả nạp đƣợc chuẩn bị có khả năng tiếp nhận plasmid. Tuy nhiên, việc xuất hiện khuẩn lạc trắng với mật độ rất cao ở các đĩa biến nạp và cả đĩa đối chứng không cho phép xác định đƣợc tỉ lệ biến nạp nào là thích hợp, đồng thời cho phép khẳng định nồng độ kháng sinh 60µg/ ml không đủ để chọn lọc thể biến nạp
Biến nạp trong 60 giây với tỉ lệ khả nạp : plasmid là 30 : 3 ; 10 : 1 ; 3 : 0.5 và đối chứng đƣợc thể hiện trên Hình 4.4. Kết quả này tƣơng tự với kết quả biến nạp trong 90 giây.
Nhƣ vậy, trong các quy trình biến nạp trên không có sự khác biệt lớn về nồng độ plasmid và mật độ vi khuẩn, cũng không có sự khác biệt lớn về thời gian biến nạp. Vì vậy, ở các lần biến nạp sau chúng tôi chọn sốc nhiệt trong 60 giây. Mặc khác, ở đĩa đối chứng mọc rất nhiều khuẩn lạc nhƣng chỉ toàn là khuẩn lạc trắng, còn ở các đĩa có trang vi khuẩn biến nạp thì có cả khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng. Điều này chứng tỏ nồng độ kháng sinh có trong môi trƣờng không đủ để loại những vi khuẩn không mong muốn. Với nhận định này, chúng tôi quyết định chọn lọc thể biến nạp với nồng độ kháng sinh là 100µg/ ml.