1. Gai môi 2,3,4 Lông môi:
2.4.2.7. Kỹ thuật ELISA phỏt hiện ký sinh trựng SR trong cơ thể muỗi (Phương phỏp Wirtz và cộng sự, 1985).
(Phương phỏp Wirtz và cộng sự, 1985).
Nguyờn lý của phương phỏp này là ứng dụng phản ứng khỏng nguyờn - khỏng thể và phản ứng enzyme - cơ chất ủể phỏt hiện KSTSR trong cơ thể muỗị
Ưu ủiểm của phương phỏp ELISA là cú thể xử lý một số lượng mẫu lớn, khụng phõn biệt mẫu sống hay mẫu chết, xỏc ủịnh chủng loại và số lượng KSTSR.
* Quy trỡnh ELISA
Đĩa gồm 96 giếng (well), ủược phủ bằng 50àl khỏng thể ủơn dũng Mab P.f, Pv 210, Pv 247, ủ qua ủờm ở nhiệt ủộ phũng. Dung dịch trong giếng ủược ủổ ra, lấy 200 àl dung dịch blocking buffer cho vào, ủ ở nhiệt ủộ phũng trong một giờ. Lấy 50àl dung dịch muỗi nghiền cho vào giếng, chứng dương và chứng õm ủược cho vào cỏc giếng qui ủịnh, ủ ở nhiệt ủộ phũng trong 2 giờ. Rửa dĩa 3 lần bằng dung dịch PBS – Tween và làm khụ. Lấy 50 àl enzyme liờn kết khỏng thể (peroxidase- conjugated MAbs) của P.f , P.v 210, P.v 247 c cho vào cỏc giếng, ủ ở nhiệt ủộ phũng trong 1 giờ. Rửa ủĩa 3 lần bằng dung dịch PBS – Tween và làm khụ. Lấy 100 àl cơ chất của enzyme cho vào cỏc giếng và ủọc kết quả ở mỏy ủọc ELISA, bước súng 405 nm (Giỏ trị ngưỡng = Trung bỡnh OD chứng õm + 3 SD).
2.4.2.8. Kỹ thuật PCR xỏc ủịnh phức hợp loài An.dirus và An.minmus
Chỳng tụi ứng dụng kỹ thuật của Ngụ Thị Hương và cs (2001).
Kỹ thuật PCR xỏc ủịnh phức hợp loài An.minimus.
Phương phỏp tỏch chiết ADN tổng số:
ADN tổng số của muỗi ủược tỏch chiết bằng QIAamp DNA Extraction kit (QIAGEN, USA). Quy trỡnh tỏch chiết ủược túm tắt như sau: Muỗi An.minimus sp. trưởng thành ủược nghiền trong 180 ml dung dịch ATL (ATL buffer) bằng
chày nhựa vụ trựng cho ủến khi thành dung dịch ủồng nhất. Bổ sung 20 ml Proteinase-K (50 mg/ml) rồi ủ 560C khoảng 2-3 giờ, cứ sau 10 phỳt lắc nhẹ một lần. Thờm vào hỗn dịch 200 ml dung dịch AL cú chứa guanidine hydrochloride và 4 ml RNase A (100 mg/ml) và trộn ủều bằng cỏch lắc mạnh khoảng 15 giõy, rồi ủ ở 700C trong 10 phỳt. Sau ủú thờm vào 200 ml Ethanol (90-100%), trộn ủều khoảng 15-20 giõỵ Toàn bộ hỗn dịch ủược chuyển lờn màng lọc của cột lọc (QIAamp Spin Column), ly tõm 13.000 vũng/phỳt trong 1 phỳt, loại bỏ phần dung dịch bờn dướị Phần AND bỏm vào màng của cột lọc ủược rữa vài lần bằng cỏc dung dịch AW1; AW2 (QIAGEN). Cuối cựng, AND tổng số ủược thụi ra bằng 100 ml dung dịch AE và ủược bảo quản ở - 200C cho ủến khi sử dụng.
Phương phỏp tiến hành phản ứng PCR:
Phản ứng PCR ủược thực hiện trờn mỏy 2720 Thermal Cycler, Applied Biosystem (USA), sử dụng cỏc cặp mồi xỏc ủịnh phức hợp loài theo Hoàng Kim Phỳc và cs (2003). Chu trỡnh nhiệt của phản ứng PCR gồm cỏc bước như sau: 940C/5 phỳt, tiếp theo là 30 chu kỳ 940C/1 phỳt, 600C/1 phỳt; 720C/1 phỳt 30 giõy và chu kỳ cuối cựng là 720C/10 phỳt. Sản phẩm PCR ủược ủiện di trờn thạch agarose 1,8%, nhuộm bằng Ethudium Bromide 5-10 phỳt.
Đọc kết quả bằng mỏy ủọc UV (UV documentation-Vilber Lourmat). Band của sản phẩm PCR ủược so sỏnh với thang chuẩn ADN ủể xỏc ủịnh kớch thước mong ủợi của từng loàị
Kỹ thuật PCR xỏc ủịnh phức hợp loài An.dirus
Phương phỏp tỏch chiết ADN tổng số:
ADN tổng số của muỗi ủược tỏch chiết bằng QIAamp DNA Extraction kit (QIAGEN Inc., USA). Quy trỡnh tỏch chiết tương tự như ủối với An.minimus.
Phương phỏp tiến hành phản ứng PCR:
Phản ứng PCR ủược thực hiện trờn mỏy 2720 Thermal Cycler, Applied Biosystem (USA), sử dụng cỏc cặp mồi xỏc ủịnh phức hợp loài theo Ngụ Thị Hương và cs (2001). Chu trỡnh nhiệt của phản ứng PCR gồm cỏc bước như sau: 940C/2 phỳt, tiếp theo là 30 chu kỳ 940C/ 30 giõy, 580C/30 giõy; 720C/30 giõy và
chu kỳ cuối cựng là 720C/10 phỳt. Sản phẩm PCR ủược ủiện di trờn thạch agarose 2%, nhuộm bằng Ethudium Bromide 5-10 phỳt.
Đọc kết quả bằng mỏy ủọc UV (UV documentation-Vilber Lourmat). Band của sản phẩm PCR ủược so sỏnh với thang chuẩn ADN ủể xỏc ủịnh kớch thước mong ủợi của từng loàị