Sau khi thu được kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến độ tinh sạch của DNA tách chiết. Nồng độ NaCl thích hợp đã được xác định, từ đó giúp giải đáp vấn đề quan trọng trong thu tách DNA- độ tinh sạch.
Khảo sát tiếp theo được thực hiện với mục tiêu quan tâm chính là lượng DNA thu tách được. Mục tiêu của thí nghiệm này nhằm tìm ra tỷ lệ thích hợp giữa hạt sắt từ với lượng mẫu cần thu tách DNA đầu vào.Các lượng hạt sắt từ khác nhau được dùng trong các thí nghiệm khảo sát này: 1mg; 1,5mg; 2mg; 2,5mg và 3mg.
Yếu tố pH, thời gian ủ và nồng độ NaCl được giữ cố định lần lượt ở pH = 8 và 15 phút và 3M.
Mật độ tế bào vi khuẩn dùng trong khảo sát này đạt 109 tế bào/ml. Qua khảo sát, việc tăng lượng hạt nano sắt từ sử dụng kéo theo sự tăng lượng DNA thu được, với giá trị A260 tăng từ 0,47 lên 0,55. Tại hai mức khảo sát là 2,5mg và 3 mg hạt sắt từ thì lượng DNA thu được là lớn nhất và không đổi.
Hình 3.7: Số lượng và độ tinh sạch của DNA khi thu tách với các lượng hạt sắt từ khác nhau.
Hình 3.8: Kết quả điện di các mẫu DNA tách bằng các lượng hạt nano sắt từ khác nhau.a,b,c,d và e : lần lượt là mẫu sử dụng các lượng hạ sắt từ 0,5mg; 1mg; 1,5mg; 2mg; 2,5mg và 3mg.
Long
Theo hình 3.8, các băng DNA điện di có bề dày tăng dần từ mẫu a đến mẫu e. Điều này cho thấy lượng DNA thu được tăng dần với sự tăng lượng hạt sử dụng. Kết quả này phù hợp với giá trị độ hấp thụ quang mà các mẫu khi ở bước sóng A260.
Với kết quả thu được, có thể ước lượng tương đối lượng hạt nano sắt từ cần sử dụng để thu tách tối đa lượng DNA từ mẫu vi khuẩn có mật độ 109 tế bào/ml là 2,5- 3 mg cho 1,5ml dịch nuôi cấy.
3.2.5.Kết quả khảo sát các nồng độ ethanol trong quá trình rửa hạt sắt từ
Phức hệ DNA và hạt nano sắt từ sau khi thu tách cần được xử lý để loại các ion, chất còn bám sót lại. Ethanol với các nồng độ khác nhau được dùng làm chất loại rửa trong nghiên cứu này. Tuy nhiên, một vấn đề đặt ra là liệu DNA có bị rửa trôi, trong khi DNA có khả năng tan trong nước. Vì vậy, các thí nghiệm khảo sát nồng độ ethanol dùng trong giai đoạn rửa được tiến hành.
Kết quả khảo sát được thể hiện ở hình 3.9.
Hình 3.9: Số lượng và độ tinh sạch của DNA khi rửa tủa ở các nồng độ ethanol khác nhau.
Lượng DNA thu được khi rửa tủa bằng ethanol tuyệt đối cho giá trị A260 cao nhất; 0,63. Trong khi, lượng DNA thu được giảm dần khi sử dụng ethanol nồng độ thấp làm chất rửa; cụ thể là giá trị A260 của mẫu khi rửa với ethanol 99% và ethanol 70% đạt 0,55; mẫu rửa với ethanol 99% và ethanol 50% đạt 0,51. Trong khi đó, các mẫu đều đạt độ tinh sạch với tỷ số A260/A280 nằm trong khoảng 1,8-2,0.
Hình 3.10: Kết quả điện di các mẫu DNA rửa với ethanol các nồng độ
1,2 và 3 : lần lượt là mẫu rửa với ethanol 50%, 99% và 70%.
Kết quả điện đi các mẫu DNA khi rửa giải bởi ethanol các nồng độ cho thấy sự khác nhau rõ rệt về lượng DNA thu lượng. Băng DNA số 2, ứng với phương pháp rửa giải dùng ethanol 99% cho vạch DNA dày nhất. Trong khi đó, lượng DNA ở băng số 1 là ít nhất.
3.2.6. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng thu hồi DNA
Trong các nghiên cứu về thu DNA bằng hạt nano sắt từ khác trên thế giới, sau giai đoạn rửa tủa, DNA được tách khỏi hạt sắt từ qua giai đoạn giải hấp. Trong giai đoạn này, tủa DNA và hạt sắt từ được hòa trong đệm TE 1X, và lắc đều ở 65oC.
Khi thêm đệm TE vào tủa để giải hấp, các phân tử nước sẽ tương tác với các phân tử DNA bằng liên kết hydro và phá bỏ sự hấp phụ giữa DNA và hạt sắt từ . Nhiệt độ cao giúp đẩy nhanh quá trình giải hấp, tuy nhiên, DNA dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao. Vì vậy, khảo sát tiếp theo này được thực hiện để đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ lên chất lượng DNA thu được.
Các mức nhiệt độ khảo sát là 25oC, 37 oC và 65 oC. Yếu tố pH, thời gian ủ, nồng độ NaCl và nồng độ ethanol được giữ cố định lần lượt ở pH = 8 ,15 phút , 3M và 99 %
Long
Hình 3.11: Số lượng và độ tinh sạch của DNA khi giải hấp ở các nhiệt độ khác nhau.
Có sự giảm rõ rệt lượng DNA thu được khi tăng giá trị nhiệt độ giả hấp (hình 3.11). Khi nhiệt độ giải hấp bằng 65 oC, lượng DNA thu được chỉ còn bằng một nửa lượng DNA thu được khi giải hấp ở 25 oC. Điều này khẳng định rằng DNA đã bị phân giải nhanh chóng ở nhiệt độ cao.
Từ các khảo sát trên, quy trình thu tách DNA từ tế bào vi khuẩn được hoàn chỉnh như sau:
Với mật độ dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis bằng 109 tế bào/ml.
+ Hút 1,5 ml mẫu dịch nuôi cấy cho vào eppendorf. Sau đó, thực hiện ly tâm 6000 vòng/phút, trong 10 phút để loại dịch nổi và thu cặn tế bào.
+ Kế tiếp, tiến hành ly giải màng tế bào: huyền phù tế bào trong 300µl đệm TE 1X pH = 8; tiếp theo, bổ sung 50 µl dung dịch NaCl 0,5 M và 50 µl dung dịch SDS 10% vào, rồi vorted để trộn đều. Sau đó, ủ dịch ở 65oC trong 10 phút, rồi ủ trên đá trong 5 phút.
+ Cho 500 µl đệm hỗ trợ gắn kết DNA và hạt nano sắt từ (PEG6000 10% và NaCl 3M) vào dịch ly giải. Đảo trộn hỗn hợp bằng cách lắc eppendorf xuôi ngược trong 5 phút. Tiếp đến, để yên eppendorf trong 5 phút.
+ Thêm 3mg hạt nano sắt từ vào ( ứng với 242µl huyền phù hạt sắt từ trong nước). Lắc đều hỗn hợp trong 7 phút, sau đó đảo 10 lần, rồi để yên 8 phút.
+ Tiếp theo, dùng nam châm hút lại hệ hạt nano sắt từ và DNA, loại dịch.
+ Kế tiếp, rửa tủa 2 lần trong 1ml ethanol 99%, rồi rửa tiếp trong 500 µl ethanol 99%, 2 lần. Sau đó loại bỏ phần dịch.
+ Giai đoạn tiếp đến, hòa tủa trong 200 µl đệm TE 1X, lắc đều trong 5 phút. + Sau cùng, thu lấy phần dịch trong chứa DNA và đem đi bảo quản.
Long