Nguyeđn taĩc: Thử nghieơm dehydrolase và decarboxylase nhaĩm xác định khạ naíng cụa moơt vi sinh có theơ toơng hợp các emzym khử nhóm carboxyl hay tách hydrogen từ các acid amin như lysine, ornithin, hay arginine, qua đó chúng làm kieăm mođi trường nuođi cây.
Cơ sở simh hoá: khử nhóm carboxyl cụa moơt acid amin là quá trình vi sinh vaơt tác đoơng leđn nhón carboxyl (-COOH) cụa moơt acid amin đeơ giại phóng ra các amin, hay di amin và CO2.
R-CH-NH2-COOH RCH2-NH2 + CO2
Amino acid amin
Enzym decarboxylase có nhât nhieău lối khác nhau, trong đó moơt lối sẽ tác đoơng leđn moơt cơ chât khác nhau. Trong các phòng thí nghieơm nghieđn cứu vi sinh vaơt gađy beơnh ba nhóm enzym decarboxylase quan trĩng thường hay sử dúng là lisine, ornithine, arginine. Đađy là những enzym cạm ứng, chúng chư được toơng hợp khi trong mođi trường nuođi cây có pH acid và có cơ chât đaịc hieơu. Các sạn phaơm cụa chúng sẽ làm cho mođi trường chuyeơn sang kieăm. Quá trình này dieên ra tređn các aminoacid có nhieău hơn moơt gôc NH2 ngoài nhóm NH2 ở Cα. trong đieău kieơn mođi trường kỵ khí, và caăn có moơt coenzym, thođng thường coenzym này là pyridoxal phosphate.
Khi enzym lisine decarboxylase tác đoơng leđn amino acid L-lisin và khử nhóm carboxyl, chúng táo thành moơt đi amin là cadaverine và CO2, quá trình dieơn ra theo phạn ứng như sau:
NH2 NH2 CH2 CH2 (CH2)3 Lisine decarboxylase (CH2)2 + CO2 CH2 CH2 NH NH2 COOH
Phạn ứng khử amin bởi lysine decarboxylase
NH2 NH2
CH2 CH2
(CH2)2 (CH2)2 +
CH NH3 CH2
COOH NH2
L-lisine Cadaverine (diamin)
CO2
Phạn ứng khử amin bởi Ornithine decarboxylase
Ornithine decarboxylase
-CO2
26 Acid amin L-ornithine bị khử nhóm carboxyl bởi enzym onithine decarboxylase sẽ thu được moơt diamin là putrescine và CO2. Cạ hai chât putrescine và cadaverine đeău beăn trong đieău kieơn kỵ khí. Vì thê khi nuođi cây vi sinh đeơ thử nghieơm, phại nuođi trong đieău kieơn kỵ khí, tređn beă maịt mođi trường nuođi cây phại được phụ moơt mới parafin hay daău khoáng đeơ ngaín cạn sự khuêch tán cụa oxy. Sau quá trình nuođi cây, pH cụa mođi trường sẽ thay đoơi veă phía kieăm, pH cụa mođi trường có theơ được kieơm soát do đó có theơ nhaơn biêt phạn ứng trong mođi trường nuođi cây bởi các chât chư thị pH. Các chât chư thị pH thường được sử dúng trong thử nghieơm này là Bromcresol purple hay cresol red.
Rieđng đôi với L-arginine có theơ được trao đoơi bởi hai con đường trong quá trình nuođi cây, thođng qua hai enzym: arginine dehydrolase và Arginine decarboxylase. Hai con đường này có theơ dieơn ra đoăng thời trong quá trình nuođi cây hay có theơ dieơn ra rieđng lẹ:
+ Phạn ứng arginine decarboxylase: quá trình trao đoơi arginine nhờ enzym arginine dehydrolase được tiên hành theo sơ đoă sau:
NH CNH2 CH2 NH2 NH (CH2)2 + CO2 (CH2)2 CH2 NH2 CH NH2 COOH Hốt đoơng cụa toàn heơ thông như sau
Decarboxylase
L-Arginine Putrescine
L-Arginine L-Agmatine + CO2
Arginine dehydrolase
Agmatinase (agmatine
ureohydrolase) Agmatinase (agmatine ureohydrolase)
Putrescine + Urea Urease 2 NH3 + CO2 NH3 + Monocarbaminyl- putrescine Putrescine + CO2 + 2 NH3
27 Theo heơ thông này, sạn phaơm sau quá trình trao đoơi chât nhaơn được agmatine và moơt lượng lớn putrescine, nhưng chât này khođng phại là sạn phaơm trao đoơi chât cuôi cùng mà chúng tham gia vào moơt lốt các phạn ứng khác, cuôi cùng sẽ thu được các sạn phaơm là CO2 và NH3.
+ Phạn ứng arginine dehydrolase: quá trình trao đoơi chât theo hướng khử hydro cụa arginine dieơn ra theo sơ đoă như sau:
Heơ thông hốt đoơng cụa vi khuaơn có heơ enzym arginine dehydrolase
Bước đaău tieđn cụa quá trình là tách hydro cụa gôc NH2 từ arginine bởi enzym arginine dehydrolase đeơ táo thành citrulline và NH3 và moơt phosphate vođ cơ. Bước tiêp theo citrulline dưới tác dúng cụa enzym citrulline ureidase có sự hieơn dieơn cụa H3PO4 đeơ táo thành ornithine và carbarmyl phosphate, chât này sẽ được thụy giại đeơ thu nhaơn ATP. Như vaơy kêt thúc quá trình sẽ thu nhaơn được ATP cho các hốt đoơng khác cụa vi sinh vaơt.
Sạn phaơm cuôi cùng cụa quá trình phađn hụy arginine cùng những sạn phaơm NH3 và CO2, đađy là những chât làm kieăm mođi trường nuođi cây. Có theơ nhaơn biêt phạn ứng này qua các chât chư thị pH hieơn dieơn trong mođi trường.
Phương pháp thử nghieơm cụa Falkow được sử dúng đôi với các vi sinh vaơt có hình que, gram ađm, nhưng phương pháp cụa Moeller cho kêt quạ tôt hơn đôi với các vi sinh vaơt thuoơc hĩ
Enterobacteriaceace. Mođi trường Falkow được sử dúng chư cho thử nghieơm Lisine
Decarboxylase, trong khi đó mođi trường Moeller được sử dúng cho tât cạ các thử nghieơm đôi với Lysine, Arginine và Ornithine.
Vi sinh vaơt được nuođi cây trong mođi trường Falkow, ụ ở 37oC trong 24 giờ, chât chư thị trong mođi trường là bromocresol purple. Nêu phạn ứng dướng tính, mođi trường giữ nguyeđn màu tím ban đaău, canh khuaơn đúc, nêu phạn ứng ađm tính, mođi trường chuyeơn từ maău tím sang vàng.
Nêu sử dúng mođi trường Moeller cho các thử nghieơm này, phại nuođi cây vi sinh vaơt trong đieău kieơn kỵ khí với daău parafin hay daău khoáng tređn beă maịt, ụ ở 37oc trong thời gian 24-28
Arginase
L-Arginine Ornithine + Urea
Urease 2 NH3 + CO2 Arginine dehydrolase L-citruline + NH3 Citrulline ureidase 2 NH3 + CO2 + L-ornithine Ornithine decarboxylase Putrescine + CO2
28 giờ. Trong mođi trường có hai chât chư thị pH: brommothymol blue và cresol red. Nêu sau khi nuođi cây mođi trường chuyeơn thành vàng là tín hieơu ađm tính, ngược lái mođi trường giữ nguyeđn màu ban đaău và đúc canh nuođi cây là tín hieơu dương tính.
Các vi sinh vaơt đôi chứng:
Lisin: dương tính: S.marcescens,ađm tính: P.rettgeri
Arginine: dương tính: E.cloacae, ađm tính: E.aerogenes
Ornithine: dương tính: S.marcescens, ađm tính: P.rettgeri