XII. CƠ CHẾ TĂNG TỐC ĐỘ CÁC PHẢN ỨNG HĨA HỌC NHỜ ENZYME
2.Sự phù hợp cảm ứng và xúc tác enzyme 3 8-
Người ta cho rằng nhiều enzyme khi khơng cĩ mặt cơ chất tồn tại ở dạng khơng hoạt động và khơng phải tất cả các nhĩm trong trung tâm hoạt động đều định hướng đúng trong khơng gian để tương tác với các nhĩm bổ sung của cơ chất. Tuy nhiên, sự kết hợp của cơ chất đặc hiệu sẽ dẫn đến sự biến đổi hình dạng trong enzyme, trong đĩ các nhĩm của trung tâm hoạt động xê dịch đến các vị trí cần thiết để sự xúc tác cĩ thể được thực hiện. Những biến đổi hình dạng được cảm ứng bởi cơ chất như vậy được gọi là sự phù hợp cảm ứng của tác dụng enzyme. Nĩ đã được minh hoạ trong hình 1.6. Nhiều dẫn chứng về hiệu ứng này đã được ghi nhận khi so sánh cấu trúc enzyme bằng phương pháp so sánh cấu trúc tinh thể bằng tia X trong các trường hợp cĩ mặt và vắng mặt chất ức chế, ví dụ đối với carboxypeptidase A và lysozyme. Thêm vào đĩ, tính chất của enzyme trong dung dịch cũng cho thấy những khác biệt về hình dạng khi cĩ mặt và vắng mặt cơ chất. Ví dụ, một số enzyme mất khả năng phản ứng với kháng thể đặc hiệu của chúng khi cĩ mặc cơ chất, cịn một số enzyme khác thì cho thấy sự khác biệt về hằng số lắng. Nĩi chung, người ta cơng nhận rằng sự phù hợp cảm ứng cĩ thể làm thay đổi tốc độ của một số phản ứng enzyme nhưng trên quy mơ tăng tốc tồn bộ thì cĩ mức độ thấp hơn các cơ chế khác.
3. Cơ chế tiếp cận.
Con đường rõ nhất để enzyme nâng cao tốc độ của một phản ứng hai phân tử (bimolecular reaction) là kéo hai chất phản ứng lại gần nhau trong trung tâm hoạt động. Các phân tử phản ứng được định hướng một cách đúng đắn và được tiếp cận với nhau làm cho nồng độ hiệu lực trở nên lớn hơn nhiều so với trong dung dịch loảng. Do các lực liên kết mạnh và đa dạng
giữa cơ chất và cấu trúc của trung tâm hoạt động, enzyme cĩ thể làm tăng khả năng để hai cơ chất cĩ thể đến với nhau để thực hiện phản ứng và biến một cách cĩ hiệu quả phản ứng hai phân tử thành phản ứng một phân tử (nội phân tử). Hiệu ứng này cĩ nhiều tên gọi khác nhau nhưng đều với ý nghĩa là sự tiếp cận.
Hiệu ứng tiếp cận cĩ thể được minh hoạ một cách rõ rệt nhất bằng mơ hình phản ứng nội phân tử và hiệu ứng của cấu trúc lên tốc độ. Bảng 7 giới thiệu cấu trúc của một số ester p-bromophenyl của suxinate và glutarate và tốc độ tương đối của các phản ứng thủy phân chúng so với tốc độ của phản ứng hai phân tử thủy phân p-bromophenylacetate với sự xúc tác của acetate. Mỗi chất bị thủy phân bằng tấn cơng nucleophyl nội phân tử của nhĩm carbonyl bên cạnh theo phương trình phản ứng tổng quát sau đây.
O O O C - OR C C - OH -RO- +H2O O- ⎯→ O ⎯→ C C C - OH O O O
Những ester cĩ cấu trúc cứng hơn tăng khả năng để nhĩm carboxyl tấn cơng được định hướng một cách thích hợp và tiếp cận hơn với liên kết ester và vì vậy chúng bị phân hủy nhanh hơn những ester cĩ khả năng quay tự do hơn và cấu trúc ít cứng hơn.
Nhiều hợp chất loại này cĩ các gĩc liên kết căng thẳng và cĩ thể xem chúng giống như những lị xo mà mức độ căng thẳng của chúng cĩ thể làm giảm một phần khi chúng tham gia trạng thái chuyển tiếp. Từ các dẫn liệu về tốc độ này cĩ thể xác định được rằng nồng độ Hiệu lực của các nhĩm
carboxyl xung quanh các nhĩm ester cĩ thể cao đến 105 - 108 M. Đĩ là nồng
độ khơng thể cĩ về mặt vật lý, song nĩ cho phép minh họa tính ưu việt của phản ứng nội phân tử đối với phản ứng giữa các phân tử và cho thấy việc mang các chất phản ứng lại gần nhau tại trung tâm hoạt động cho phép tăng tốc độ phản ứng nhanh đến mức nào.
Bảng 7. Cấu trúc và tốc độ tương đối (Vr ) của các phản ứng thủy phân các ester monophenyl của các ion acid dicarboxylic.
* R = p-Br-C6 H4 - ; # tốc độ phụ thuộc vào bản cất của R
4. Gây mất ổn định (Destabilization).
Một giả thuyết tương đối cũ về xúc tác enzyme cho thấy rằng sự liên kết của trung tâm hoạt động làm cho các liên kết bị căng, biến dạng hoặc mất ổn định nên dễ bị đứt khi hình thành một sản phẩm hoặc phức hệ trung gian mà trong đĩ các liên kết bị tác động trở nên kém bền vững hơn so với trong chất phản ứng ban đầu. Ví dụ minh hoạ cho giả thuyết này là phản ứng
do base xúc tác khi thủy phân ethylene-phosphate xảy ra nhanh gấp 107 lần
so với khi thủy phân dimethyl-phosphate. H H H C ⎯⎯ C H CH3 CH3 O O O O P P O O O O Ethylene-phosphate Dimethyl-phosphate
Giả thuyết về tính căng này cĩ vẻ là một cách giải thích hấp dẫn đối với xúc tác enzyme. Một trong những ví dụ thiết thực là tính chất của esterase của gan. Để thủy phân một loạt các ester
của acid m-hydroxy-benzoic, Km hầu như khơng phụ
thuộc vào chiều dài của chuỗi R, trong khi đĩ Vmax
tăng lên một số bậc khi chiềudài của chuỗi tăng. Vì liên kết chịu sự thủy phân là như nhau trong mỗi trường hợp, nên cĩ thể suy ra rằng tăng năng lượng liên kết củacác ester mạch dài làm giảm năng lượng
hydrocarbon được bù đắp bởi sức căng được cảm ứng trong phần chứa nhĩmacyl của phân tử.
Sự gây mất ổn định cơ chất cũng cĩ thể xảy ra khi các cơ chất tích điện ở dạng hịa tan, tức khi kết hợp với trung tâm hoạt động, những cơ chất này cĩ thể được chuyển từ mơi trường nước vào mơi trường tương đối kỵ nước trong trung tâm hoạt động, nhờ đĩ cho phép cĩ sự gia tốc lớn. Mơ hình phản ứng dùng để minh họa hiệu ứng này là phản ứng decarboxyl-hĩa một dẫn xuất của pyruvate và một đồng dạng của thiaminepyrophosphate xảy ra như sau:
Dẫn xuất này (I) tương đối ổn định trong nước và phản ứng
decarboxyl-hĩa xảy ra chậm, nhưng trong ethanol nĩ bị decarboxyl-hĩa 104-
105 lần nhanh hơn để tạo ra CO2 và dẫn xuất III.
Người ta cho ra cho rằng tốc độ decarboxyl-hĩa tăng lên là do ở trạng thái trung gian giả định (II) điện tích khu vực bị giảm so với trong dẫn xuất I. Đây là một dẫn chứng cho thấy rằng kiểu nâng tốc độ này cĩ thể xảy ra đối với pyruvate decarboxylase mà cofactor là thyamine pyrophosphate vì cofactor này cĩ thể nằm tại khu vực cĩ tính kỵ nước tương đối của enzyme.
5. Xúc tác acid-base phối hợp.
Cĩ nhiều phản ứng xúc tác bằng acid hoặc bằng base trong hĩa hữu cơ, ví dụ sự hình thành semiacetal được xúc tác bởi acid hoặc base.
Base OH- thúc đẩy sự hình thành semiacetal như sau:
CH3 CH3
OH (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
C = O + CH3OH C
H H OCH3
Xúc tác bằng acid dẫn đến hình thành muối oxonium để sau đĩ tiếp tục phản ứng với alcohol:
Những dẫn chứng cĩ được hiện nay cho phép giả thiết rằng nhiều nhĩm trong trung tâm hoạt động của enzyme cĩ thể thực hiện xúc tác theo kiểu acid hay base đối với các nhĩm khác nhau trong cơ chất và bằng cách đĩ tham gia đẩy nhanh tốc độ phản ứng. Xúc tác phối hợp acid-base đặc biệt cĩ hiệu qủa và một ví dụ minh họa là phản ứng chuyển quay của tetramethyl-glucose xảy ra như sau:
Acid và base đều xúc tác cho sự chuyển quay. Chẳng hạn, khi một trong hai dạng anomer hịa tan trong benzen và thêm vào hỗn hợp của phenol và pyridine thì quá trình chuyển quay xảy ra rất nhanh. Động học của sự chuyển quay cho thấy rằng tốc độ phụ thuộc vào nồng độ của phenol và pyridine cũng như của tetramethylglucose. Điều đĩ cho phép giả thiết rằng phenol và pyridine hoạt động như các chất xúc tác acid và base một cách đồng thời. Hơn thế nữa, nếu các nhĩm chức năng của phenol và pyridine
cùng nằm trong một phân tử duy nhất, ví dụ như trong α-pyridon (α-
hydroxylpyridine) thì sẽ cĩ được một chất xúc tác cĩ hiệu qủa cao hơn nhiều,
mặc dù thậm chí các nhĩm xúc tác trong α-pyridon là những acid và base
yếu hơn nhiều so với phenol và pyridine. Người ta cho rằng α-pyridon thể
Như vậy, hydro trên nitơ của pyridine (một acid) cho proton, cịn oxy của nhĩm carbonyl (một base) nhận proton khi vịng pyranose của
β-anomer bị mở.
Nitơ của pyridine nhận proton từ sản phẩm trung gian cĩ cấu trúc mở, trong khi đĩ nhĩm hydroxyl phenol cho proton khi vịng đĩng lại để tạo ra
dạng α-anomer.
Kiểu xúc tác acid-base phối hợp này xảy ra trong các cơ chế xúc tác của một số enzyme, trong đĩ cĩ ribonuclease. Rất ít cĩ khả năng là kiểu xúc tác này làm tăng tốc độ phản ứng cao hơn bậc 10 hoặc bậc 100, nhưng cùng với các cơ chế khác nĩ đĩng gĩp vào việc nâng cao tốc độ của các phản ứng enzyme.
Nhiều gốc R của aminoacid hoạt động như kiểu xúc tác phối hợp acid- base trong enzyme, bao gồm các gốc acid glutamic, acid aspartic, histidine, lysine, tyrosine và cysteine. Ở dạng proton-hĩa chúng là những chất xúc tác acid, cịn ở dạng khơng proton-hĩa chúng là những chất xúc tác base. Rõ ràng là hiệu quả của các gốc R trong việc xúc tác sẽ phụ thuộc vào pK của mỗi nhĩm chức năng và pH mà tại đĩ xảy ra phản ứng enzyme.
Bảng 8 giới thiệu một số enzyme mà trong quá trình xúc tác tạo ra các phức hệ enzyme-cơ chất trung gian liên kết đồng hĩa trị Thơng thường những chất trung gian này hồn tồn cĩ thể được xác định. Ví dụ, phức hệ acetyl-chymotrypsin hình thành trong quá trình thủy phân p- nitrophenylacetate bằng chymotrypsin là một chất bền với pH acid và đã được thu nhận ở dạng chế phẩm.
O O
O2N– – O - C CH3 C HO → C O - C - CH3 + O2N– –OH
p-Nitrophenylacetate chymotrypsin Acetyl-enzyme p-Nitrophenol
Các nhĩm thiol của cystein trong các enzyme thủy phân protein papain và ficin cũng tham gia tạo các chất trung gian đồng hĩa trị với cơ chất. Thioester gắn với enzyme được hình thành cùng với nhĩm carboxyl của liên kết peptide như sau:
O O
Enz-SH + R-C-NH-R' Enz-S-C-R + H2N-R'
O O
Enz-S-C-R + H2O Enz-SH + R-C-OH
Bảng 8. Một số enzyme mà trong cơ chế xúc tác cĩ sự hình thành sản phẩm trung gian enzyme-cơ chất liên kết đồng hĩa trị.
Loại enzyme Nhĩm phản ứng Kiểu sp. trung gian đồng hĩa trị
Chymotrypsin,trypsin,subtil isin, elastase, thrombin, plasmin, acetylcholin esterase HO-CH2-CH Serine O R-C-O-CH2OH Acyl ester Phosphoglucomutase,
phosphatase kiềm HO-CH2-CH
Serine O - O-P-O-CH2 -CH O- Phosphoryl ester Papain, ficin, glyceraldehyde phosphate dehydrogenase HS-CH2-CH Cystein O R-C-S-CH2 -CH Acyl thioester Suxinic thiokinase, glucoso-6-phosphatase -CH2 - CH HN N Histidine -CH2 -CH O - O - P - N N O- Phosphoimidasole Aldolase, transaldolase, pyridoxalphosphate enzyme NH2 -[CH2]4 -CH Lysine R R-C=N-[CH2]4 -CH Base Schiff
Một dạng liên kết đồng hĩa trị khác giữa enzyme và cơ chất là trường hợp hình thành base schiff (aldimine) giữa các hợp chất carbonyl (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
với nhĩm ε-amine của lysine trong một số enzyme. Ví dụ, khi
dihydroxyacetone phos- phate được ủ với aldolase mà khơng cĩ mặt glyceraldehyde-3-phosphate thì phản ứng sau đây sẽ xảy ra:
CH2OH CH2OH
Enz-(CH2)4 -NH2 + O =C Enz-(CH2)4 -NH =C + H2O CH2O P CH2O P
Tính ưu việt chủ yếu của sự hình thành các chất trung gian đồng hĩa trị enzyme-cơ chất là ở chỗ chúng làm tăng xác suất để một phản ứng xác
định cĩ thể được thực hiện. Một chất trung gian liên kết đồng hĩa trị với enzyme buộc cơ chất bị giam hãm chặt chẽ bên trong trung tâm hoạt động và cĩ thể được đặt vào tư thế thuận lợi hơn cho phản ứng kê tiếp với các nhĩm thích hợp tại trung tâm để hồn thành phản ứng. Mức độ thúc đẩy tốc độ bằng cách tạo ra các chất trung gian đồng hĩa trị cĩ thể khá lớn, ví dụ đối với aldolase, song trong các trường hợp khác nĩ cĩ thể khơng lớn hơn mức 102 -103 .
XIII. ISOENZYME
Nhiều enzyme trong cùng một cơ thể, thậm chí trong cùng một tế bào, tồn tại ở nhiều dạng phân tử khác nhau. Những dạng phân tử đĩ của cùng
một enzyme được gọi là isoenzyme. Chúng thường được tách khỏi nhau một
cách dễ dàng bằng phương pháp điện di.
Ví dụ lactate dehydrogenase trong các mơ của chuột bạch cĩ 5 dạng isoenzyme mà ngày nay đã tách được ở dạng tinh khiết. Chúng đều xúc tác
cho một phản ứng như nhau, song giá trị Km của chúng rất khác nhau. Cả 5
dạng này đều cĩ trọng lượng phân tử vào khoảng 134.000 và chứa 4 chuỗi polypeptide (trọng lượng phân tử của một chuỗi là 33.500).
5 isoenzyme là 5 kiểu phối hợp khác nhau của hai loại chuỗi polypeptide – chuỗi M và chuỗi H. Một isoenzyme chiếm ưu thế trong cơ
được cấu tạo từ 4 chuỗi M giống hệt nhau (ký hiệu là M4). Isoenzyme thứ hai
chiếm ưu thế trong tim, ký hiệu là H4, được hình thành từ 4 chuỗi H. Ba
isoemzyme cịn lại, ký hiệu là M3H, M2H2 và MH3. Người ta đã tách riêng
được các chuỗi M và H. Ở trạng thái này chúng khơng cịn khả năng xúc tác. Hai loại chuỗi cĩ thành phần và trật tự aminoacid khác nhau. Khi trộn trong ống nghiệm hai loại chuỗi với tỉ lệ tương ứng các kiểu isoenzyme khác nhau sẽ tự động xuất hiện.
Sự tổng hợp các chuỗi M và H được mã hĩa bởi hai gen khác nhau, Như vậy, tỉ lệ tương đối của chúng trong mỗi loại isoenzyme được kiểm tra ở mức độ gen và cĩ thể biến đổi trong quá trình phát triển của phơi.
Việc nghiên cứu isoenzyme cĩ ý nghĩa rất quan trọng đối với việc tìm hiểu cơ sở phân tử của sự phân hĩa tế bào và phát sinh cơ quan. Người ta cho rằng khơng những enzyme mà nhiều loại protein cũng tồn tại trong tế bào ở các dạng khác nhau, phân biệt nhau bởi tỉ lệ giữa các chuỡi polypeptide vốn được mã hĩa bởi các gen khác nhau.
XIV. CÁC NHĨM ENZYME
1.Enzyme oxy hĩa - khử.
Trong các phản ứng oxy-hĩa - khử sinh học điện tử từ cơ chất được vận chuyển đến oxy khơng khí theo từng bước trên cơ sở giảm dần thế khử tiêu chuẩn. Mỗi enzyme oxy hĩa - khử hoạt động nhờ sự phối hợp của một nhĩm chức năng gọi là cofactor hoặc coenzyme.
Mặc dù cĩ hàng trăm loại enzyme oxy hĩa - khử khác nhau tham gia
trong các quá trình oxy-hĩa sinh học, song chỉ cĩ một số rất ít các cofactor hoặc coenzyme làm nhiệm vụ nhận hoặc nhường điện tử giữa cơ chất và sản phẩm. Ví dụ, người ta đã phát hiện được trên 250 enzyme đều sử dụng các
coenzyme nicotinamide nucleotide (NAD+ hoặc NADP+) làm chất nhận điện
tử. Chúng xúc tác cho các phản ứng cĩ dạng dưới đây: AH2 + E.NAD+ A + E.NAD.H + H+
và AH2 + E.NADP+ A + E.NADP.H + H+
Thế khử của cơ chất (AH2) được chuyển cho NAD.H (hoặc NADP.H)
để sau đĩ sẽ tham gia trong các quá trình oxy hĩa - khử khác. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Một số dehydrogenase khác sử dụng các flavine nucleotide (F) làm
coenzyme và xúc tác các phản ứng cĩ dạng tổng quát sau đây: AH2 + E.F E.FH2 + A
Enzyme ở dạng khử (E.FH2) cĩ thể vận chuyển điện tử và proton của
nĩ cho các chất khác (ví dụ trong quá trình phosphoryl hĩa oxy-hĩa) hoặc cho O2 để tạo ra H2O2 :
E.FH2 + O2 E.F + H2O2 .
Xúc tác cho các phản ứng loại này là các enzyme thuộc nhĩm oxydase. Cofactor của các enzyme loại này cĩ thể là các ion kim loại như
Cu2+, Fe2+ hoặc các hợp chất hữu cơ tương đối phức tạp mà chúng ta sẽ xét
đến sau.
Các enzyme oxy hĩa - khử của chuỗi vận chuyển điện tử trong ty thể