Chọn 4 đến 7 khuẩn lạc trắng của mỗi mẫu để chạy phản ứng colony-PCR với cặp mồi pUC18-xuôi và pUC18-ngƣợc để xác định khuẩn lạc có plasmit mang đoạn DNA mong muốn. Vì hai mồi nằm trên vectơ nên kích thƣớc của đoạn DNA
đƣợc khuếch đại sẽ lớn hơn đoạn DNA mong muốn khoảng 0,2Kb [4]. Sản phẩm colony-PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,9% (Hình 3.5, Hình 3.6).
.
Hình 3.5. Điện di sản phẩm colony-PCR từ
các dòng của phân đoạn 1 và 4 RGSV bằng cặp mồi pUC 18
M: Thang chuẩn 1Kb; (+). Đ/c dƣơng; (-). Đ/c âm; 1,2. phân đoạn 1; 3,4. phân đoạn 4. Kết quả điện di trên hình 3.5 cho thấy tại giếng đối chứng dƣơng xuất hiện băng điện di có kích thƣớc khoảng 0,6Kb đây là kích thƣớc của đoạn DNA đã xác định trong plasmit sử dụng để PCR, giếng đối chứng âm không lên băng chứng tỏ thành phần phản ứng không lây nhiễm DNA, phản ứng diễn ra đạt yêu cầu. Tại các giếng 1, 2, 3, 4 xuất hiện băng có kích thƣớc khoảng 0,6Kb. Đây là kích thƣớc phù hợp với phân đoạn 1 và 4 của RGSV. Nhƣ vậy, có thể plasmit của các khuẩn lạc tƣơng ứng với các giếng số 1, 2, 3, 4 đều mang đoạn DNA có kích thƣớc tƣơng ứng với phân đoạn 1 và 4 của RGSV.
Hình 3.6. Điện di sản phẩm colony-PCR các dòng RGSV bằng cặp mồi pUC 18.
M: Thang chuẩn 1 Kb; (-): Đ/c âm; (+): Đ/c dƣơng; 1, 2, 3, 4, 5, 6: mẫu NT; 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13: mẫu BT.
~1Kb 0,5 Kb
Dựa vào kết quả điện di trên hình 3.6 thấy rằng, các giếng số 1, 2, 6 và 13 xuất hiện băng tƣơng đƣơng với kích thƣớc của băng đối chứng dƣơng. Nhƣ vậy, có thể plasmit của các khuẩn lạc tƣơng ứng với các giếng số 1, 2, 6 và 13 mang đoạn DNA đã ligation ban đầu. Plasmit của khuẩn lạc tƣơng ứng với các giếng còn lại không mang đoạn DNA mong muốn.
Phƣơng pháp colony-PCR có tác dụng loại trừ phần lớn các khuẩn lạc (trắng) mang plasmit không mong muốn. Từ kết quả colony-PCR, chúng tôi lựa chọn các dòng khuẩn lạc 1, 3 (Hình 3.5) và 1, 2, 13 (Hình 3.6) để nuôi trong môi trƣờng LB lỏng có bổ sung ampicillin 100mg/l. Sau đó, chúng tôi tiến hành tách plasmit từ các khuẩn lạc đã nuôi trong môi trƣờng LB lỏng để phục vụ cho việc xác định trình tự.