Bƣớc đầu tiên trong quá trình cắt gen bằng enzym giới hạn, chúng ta phải xác định những enzym có thể sử dụng để cắt đƣợc đoạn gen quan tâm. Những enzym đƣợc lựa chọn là những enzym dự tính không có điểm cắt trên đoạn gen quan tâm, không có quá nhiều vị trí cắt trên vectơ. Đặc biệt, những enzym cắt
không cho các đoạn gen có kích thƣớc chênh lệch nhỏ, vì nhƣ vậy, không thể xác định đƣợc đoạn gen quan tâm. Sau khi đã xác định đƣợc enzym cắt giới hạn, đối chiếu với bảng enzym để xác định đƣợc đệm phù hợp nhất, cho khả năng cắt cao nhất. Tiến hành cắt enzym, cho lần lƣợt các thành phần theo thứ tự: Đệm cho enzym cắt, chất phụ trợ (nếu có), plasmit, enzym. Hỗn hợp đƣợc cắt ở 37o
C trong 02 tiếng, bất hoạt enzym ở 65o
C trong 20 phút.
Thành phần phản ứng cắt bằng enzym giới hạn : DNA plasmit 2,5- 3 µg/µl (5µl); Enzym 10u/µl (1µl); Dung dịch đệm 10X (1µl); H2O khử ion (3,5µl ). Tổng thể tích là 10µl.
2.3.10. Xác định trình tự và so sánh trình tự gen thu đƣợc với các trình tự tƣơng ứng trên GenBank
Tách dòng và xác định trình tự gen: Sản phẩm PCR đƣợc gắn vào trong vector tách dòng pBT [4] và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Chọn lọc các khuẩn lạc xanh/trắng trên môi trƣờng thạch LB có bổ sung 50 mg/l Ampicilin, 0,004% X-gal và 0,1 mM IPTG. Tách chiết plasmit theo hƣớng dẫn sử dụng của Plasmit Extraction Kit. Kiểm tra sự có mặt của DNA tái tổ hợp bằng phƣơng pháp colony-PCR với cặp mồi pUC18-xuôi và pUC18-ngƣợc. Chọn các mẫu plasmit tái tổ hợp có kích thƣớc nhƣ mong muốn để tinh sạch và xác định trình tự trên máy tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Sử dụng các phần mềm DNAstar, BioEdit và MEGA 4 để so sánh các trình tự gen và dựng cây phát sinh chủng loại theo phƣơng pháp tối đa (Maximum Parsimony (MP)) trên cở sở các số liệu thu đƣợc qua so sánh các trình tự gen.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN