chiết hypericin
Trong thí nghiệm chiết 100 g bột nguyên liệu trên bộ dung cụ Soxhlet 2,5 lít, Lượng dung môi Metanol/Nước/NaOH cần dùng là 1,5 lít. Dung dịch được pha theo tỷ lệ 1200 ml Metanol + 300 ml Nước + 1,5 g NaOH (Nồng độ đạt 0,5 % trong dung dịch nước), pH của dung dịch trước khi chiết đạt ~ 9. Sau khi chiết 1 giờ, do nồng độ các hợp chất phenol tăng lên, pH giảm nhanh về môi trường axít khoảng 5 - 6. Lúc này có thể bổ xung dần NaOH vào bình đun để giữ môi trường trung tính, tăng tính tan của các hợp chất anthron → tăng hiệu quả chiết. Chúng tôi đã thực hiện 5 thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tốc độ và lượng NaOH thêm vào trong quá trình chiết tới hiệu quả chiết hypericin (Bảng 3.3và Hình 3.6).
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của NaOH bổ xung tới hiệu quả chiết hypericin Thí nghiệm % Hypericin/cao chiết Lượng cao chiết % Hypericin/ng.liệu
Không bổ xung NaOH 0,31 % 39 g 0,121 % Bổ xung 1 g NaOH trong các thời
gian 2 giờ 0,31 % 40 g 0,124 %
Bổ xung 2 g NaOH trong các thời
gian 2 và 3 giờ 0,29 % 36 g 0,104 %
Bổ xung 3 g NaOH trong các thời
gian 2, 3 và 4 giờ 0,26 % 30 g 0,078 %
Bổ xung 4 g NaOH trong các thời
gian 2, 3, 4 và 5 giờ 0,22 % 22 g 0,048 %
Hình 3.6: Ảnh hưởng của NaOH bổ xung tới hiệu quả chiết
Kết quả khảo sát cho thấy, việc bổ xung thêm kiềm trong quá trình chiết chỉ có ý nghĩa khi bắt đầu chiết được một thời gian ngắn (1 giờ), điều chỉnh môi trường
0 50 100 150 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 Lượng NaOH (g) HI ệ u qu ả % Hyper/Cao x 100 Số g cao chiết % Hyper/N.liệu
chiết về trung tính. Sau đó, việc duy trì môi trường kiềm ở nhiệt độ cao kéo dài sẽ làm các anthron bị khử mạnh, làm xảy ra các phản ứng ôxy hóa - khử hóa phức tạp, gây phân hủy các thành phần trong dịch chiết và làm giảm cả chất lượng lẫn khối lượng sản phẩm về sau. Như vậy, không cần thiết phải bổ xung NaOH khi đã bắt đầu chiết Soxhlet thu sản phẩm Cao chiết Hypericum.
3.3.2 Thử nghiệm chiết xuất lượng lớn Cao chiết Hypericum và phân lập hypericin 90 % và phân lập hypericin 90 %
Từ các kết quả nghiên cứu hoàn thiện quy trình chiết Cao Hypericum, chúng tôi đã tiến hành điều chế lượng lớn cao chiết này từ toàn bộ lượng nguyên liệu đã thu thập được; các thông số công nghệ chiết cho một mẻ chiết như sau:
+ Lượng bột nguyên liệu khô: 1,5 kg; + Thời gian chiết defatted bằng n-hexan: 1,0 giờ;
+ Lượng n-hexan hao phí không thu hồi lại: 1,5 lít; + Thời gian chiết metanol: 8,0 giờ;
+ Lượng metanol hao phí không thu hồi lại: 1,5 lít;
+ Lượng NaOH sử dụng: 22,5 g;
+ Lượng axít photphoric đã sử dụng: 50,0 g. Kết quả từ 9 kg bột nguyên liệu Hypericum đã chiết xuất được 3,6 kg sản phẩm Cao Hypericum. Sản phẩm màu nâu đỏ, hàm lượng Hypericin đạt 0,31 %.
Đã đưa 3 kg Cao chiết vào tinh chế bằng phương pháp kết tủa và rửa lọc lại lần lượt với dung dịch NaH2PO4 0,5 M và dung dịch H3PO4 0,5 M, kết quả thu được 250 g bột Hypericin thô - H2 (Xem thêm Sắc ký đồ phân tích LC mẫu H2 trang 28). Bột này đã được tiến hành tách sắc ký điều chế MPLC theo điều kiện tách dưới đây: + Cột tách: ID 50 x L 350 mml
+ Pha tĩnh: Merck LichroPrep RP-C18 (40 - 63 µm); + Lượng mẫu nạp lên cột tách: 5 g;
+ Pha động: Metanol/Etyl axetat/H3PO4 (pH 2,5) tỷ lệ 2 : 1 : 1 - v/v; + Tốc độ dòng pha động: 20 ml/phút.
Kết quả đã thu nhận được 11,2 g Hypericin có hàm lượng 90 %.
Như vậy, các kết quả triển khai thử nghiệm lượng lớn hoàn toàn phù hợp với các kết quả khảo sát thông số trong phòng thí nghiệm, chứng tỏ quy trình ổn định và khả thi để tiếp tục phát triển hoàn thiện ở quy mô lớn hơn.
3.4 Thử nghiệm hoạt tính chống Virus
3.4.1 Nghiên cứu điều chế chế phẩm chống Virus Influenza Typ A cho gia cầm
Như đã biết, hypericin ở dạng tinh khiết và trong cao chiết Hypericum đều thể hiện hoạt tính kháng nhiễm và tiêu diệt virus cúm Typ A [3 - 6, 8, 9]. Trong các thử nghiệm in vitro, ở nồng độ 0,15 mg/L hypericin đã ức chế hoàn toàn sự phát triển của virus cúm A. Ở châu Âu, để phòng bệnh, các bác sỹ khuyên nên thường xuyên sử dụng trà thảo dược chứa hypericin 25 µg/kg thể trọng/ngày đêm [8]. Trong thử nghiệm năm 2005 tại Trung Quốc, người ta đã dùng tới liều 10,8 mg/ngày/gà nhiễm H5N1.
Hypericin là loại hoạt chất không có độc tính, tuy nhiên do có tác động lên hệ thần kinh vận động nên trong điều trị thường sử dụng chỉ định theo đơn thuốc. Theo Hội đồng châu Âu, liều điều trị tối đa không vượt quá 10 mg/kg thể trọng/ngày [Directive 88/388/EEC].
Xuất phát từ các căn cứ nêu trên, dựa vào các tham khảo tài liệu, chúng tôi đã thử điều chế một dạng chế phẩm thực phẩm phòng chống cúm gia cầm, thành phần bao gồm cám, Canxi hidrophotphat và Cao Hypericum. Trong đó, Canxi hidrophotphat làm đệm kiềm yếu nhằm làm giảm tác dụng dịch vị giúp cho cơ thể kịp hấp thụ trước khi thuốc bị ngưng tụ trong môi trường axít. Cám có tác dụng như một chất mang đối với hoạt chất, đây cũng là một thành phần thức ăn gia cầm.
Cụ thể pha chế như sau:
+ Cám: 49,0 % khối lượng;
+ Cao Hypericum 0,3 % hypericin: 50,0 % khối lượng; + CaHPO4.2H2O: 1,0 % khối lượng. Chế phẩm sẽ có thành phần hoạt chất chính ~ 1,5 g hypericin/kg.
Các thành phần được nghiền trộn kỹ trong máy trộn khô thành bột mịn đến dưới rây 0,15 mm rồi đóng vào túi phòng ẩm có vỏ bao chắn ánh sáng. Sử dụng 1 kg chế phẩm cho 3000 kg gia cầm/ngày khi phòng và chống dịch.
3.4.2 Thử nghiệm in vitro hoạt tính chống virus của sản phẩm Cao Hypericum